Идентифициране на вируси чрез цитопатичен ефект
Цитопатичен ефект - клетъчна дегенерация, която възниква под действието на вирус, който се размножава в тъканна култура. Микроскопски, цитопатичният ефект се изразява в различни промени в морфологията на клетките, образуването на гигантски многоядрени клетки (симпласти), пикноза на ядрата и накрая, пълно унищожаване на клетките. Макроскопски видима десквамация на клетки от стените на епруветката. Характерът на клетъчната дегенерация зависи главно от вида на вируса.
1. Приготвяне на лекарството от нишковидни гъби.
2. Препарат-натривка от дрождеподобни гъбички Candida albicans.
3. Схеми на морфология и структура на рикетсии и хламидии.
4. Токсоплазма, малариен плазмодий в готови препарати.
5. Схема на структурата на вирусните частици.
6. Телата на Бабеш - Негри в мозъчната тъкан на животно, умряло от
7. Схема на структурата на бактериофагите.
8. Титруване на бактериофаг по Appelman и по Grazia.
9. Биологични препарати от бактериофаги.
1. Всеки ученик подготвя по 1 препарат от нишковидни гъби, микроскопия, скици в албум.
2. Всеки ученик изготвя препарат от дрождена клетъчна култура, оцветява по Найсер, микроскопира, скици.
3. Изготвяне на намазка от рикетсиален диагностикум.
4. Всеки студент подготвя препарат от култура на гъби Candida albicans, оцветява по Грам (или метиленово синьо), микроскопира и скици.
5. Студентите изучават бактериални препарати от бактериофаги.
1. Какви са морфологичните разлики между аскомицетите и фикомицетите?
2. Как гъбите се различават от бактериите по морфология?
3. Какво място заемат спирохетите в системата на микроорганизмите?
4. Какви видове спирохети са от медицинско значение?
5. Какви бактерии са облигатни вътреклетъчни?
6. Какви свойства показват, че рикетсията принадлежи към бактериите?
7. Кое е основното биологично свойство, което доближава рикетсията до вирусите?
8. Каква е формата на рикетсията?
9. Какъв механизъм осигурява вътреклетъчното оцеляване на рикетсиите?
10. Какви свойства показват, че хламидията принадлежи към бактериите?
11. Каква е особеността на жизнения цикъл на хламидиите?
12. Каква е особеността на функционалната организация на протозоите в сравнение с бактериите?
13. Назовете видовете протозои, които включват видове, патогенни за човека.
14. Какво стои в основата на диагностиката на протозойните инфекции?
15. Какви са структурните елементи на вирионите?
16. Какви биологични свойства отличават вирусите от другите микроорганизми?
17. Какви свойства са в основата на класификацията на вирусите?
18. Как се размножават вирусите?
19. Какви промени могат да настъпят в клетката в резултат на заразяването й с вирус?
20. Какво представляват елементарните вирусни частици? Как могат да бъдат идентифицирани?
21. Какви структурни елементи има фаговата частица?
22. Каква е разликата между вирулентен бактериофаг и умерен?
23. Какви фази на взаимодействие между вирулентен фаг и бактериална клетка познавате?
24. Какво представлява явлението лизогения?
25. Как да измерим количеството фагови частици в материала?
26. За какви цели се използват бактериофагите в медицината?
Тема:
•Физиология на бактериите. Хранене и култивиране на бактерии и
Вирус.
План на урока:
1. Хранене и култивиране на бактерии. Класификация на хранителните среди.
2. Култивиране на рикетсии, хламидии и вируси.
3. Методи за инокулация и субкултури на бактериални култури, методи за изолиранечисти култури: според Дригалски, Голд, Кох и биобактериологични.
Физиологията на микробите изучава въпросите на храненето, ензимите, растежа и размножаването на микробите, техния конструктивен и енергиен метаболизъм.
Микробната клетка се нуждае от енергия, за да расте и да се възпроизвежда. Освобождава се по време на редокс реакции. Навлизането на хранителни вещества в бактериалната клетка се осъществява главно поради осмоза и дифузия, както и обменна адсорбция. Културалните среди се използват за култивиране на бактерии. Те се използват за получаване на чисти култури от микроорганизми, изследване на особеностите на тяхната морфология и физиология, както и за запазване на микроорганизми под формата на чисти култури в лабораторни и производствени условия. Всяка хранителна среда трябва да отговаря на следните изисквания: да съдържа всички хранителни вещества, необходими за растежа, в лесно смилаема форма; имат оптимално съдържание на влага, вискозитет, рН, да са изотонични, балансирани с висок буферен капацитет и, ако е възможно, прозрачни. За растежа на автотрофните бактерии нуждите от хранителни вещества са съвсем прости: вода, въглероден диоксид и подходящи неорганични соли. Хетеротрофните бактерии получават енергия от окисляването на редуцирани въглеродни (органични) съединения. Някои от тях, като Е. coli, могат да растат върху проста среда, съдържаща само глюкоза и неорганични соли. Други, като млечнокисели бактерии, растат върху сложни среди, съдържащи като добавки редица органични съединения (витамини, аминокиселини и др.), които клетките не са в състояние да синтезират сами. Такива съединения се наричатрастежни фактори. Организмите, които изискват добавянето им към растежната среда, се наричатауксотрофни отсъответните връзки. Друга група организми, способни да растат върху проста среда, съдържаща източник на въглерод и енергия, както и набор от основни биогенни елементи, се наричат прототрофни. Трябва също така да се има предвид, че в природата има бактерии, които могат да се размножават на места с нисък хранителен въглероден поток - до 0,1 mg / l на ден, те се наричат олиготрофни, противоположната група за тях са бактериикопиотрофни , способни да растат върху богати хранителни субстрати.
По отношение на състава средите се делят на естествени, изкуствени и синтетични. Естествената хранителна среда е естествен продукт от животински или растителен произход - мляко, яйца, зеленчуци, животински тъкани, жлъчка, кръвен серум. Изкуствените среди се приготвят по определени рецепти от различни инфузии или отвари от животински или растителен произход с добавяне на неорганични соли, въглехидрати и азотни вещества. Синтетичните среди съдържат определени химични съединения в точно определени концентрации. Например, минималната среда на Lederberg често се използва за генериране на ауксотрофни мутанти. В такава среда се култивират прототрофи, като се използва глюкозен въглерод като единствен източник на въглерод и амониеви съединения като единствен източник на азот.
Според консистенцията средите са течни, полутечни, плътни, рохкави и сухи. Течните среди по-често се използват за изследване на физиологичните и биохимичните характеристики на микроорганизмите, за натрупване на биомаса и метаболитни продукти. Полутечните среди обикновено се използват за съхранение на култури, плътни среди за изолиране на микроорганизми, изследване на морфологията на колониите, диагностични цели, количествено отчитане, определяне на антагонистични свойства и др.
Насипно състояниеСредите обикновено се използват за съхранение на инокулум, продуцентски култури в микробиологичната и медицинската промишленост. Те включват варено просо, кварцов пясък, напоен с хранителен разтвор. Понастоящем като уплътнители се използва агар, по-рядко желатин и силикагел. Агарът е полизахарид, изолиран от морски водорасли. Той е в състояние да образува гелове във вода, топящи се при 100°C и уплътняващи при 45°C и по-ниски, които не се използват от микроорганизмите като хранителен субстрат. Няколко цикъла на топене и втвърдяване не влияят на способността на агара да образува гел, така че агаровата среда може да се стерилизира няколко пъти. Към средата се добавя агар в количество от 1,5-2% за плътна среда или 0,4-0,7% за полутечна среда, която може да се използва за дългосрочно съхранение на културата без повторно засяване.
В бактериологичната практика най-често се използват сухи хранителни среди, които се получават в промишлен мащаб - триптични хидролизати на евтини нехранителни продукти (рибни отпадъци, месо и костно брашно, технически казеин) и хранителен агар. Сухите среди могат да се съхраняват дълго време, лесно се транспортират и имат сравнително стандартен състав.
Микротест - системи (MTS). Те представляват полистиренови плаки с ямки, съдържащи стерилна диференциално диагностична среда. Стерилизацията на MTS се извършва чрез UV облъчване. Microtest - системите са особено удобни за масови бактериологични изследвания в практически лаборатории.
По предназначение средите се разделят на обикновени (прости), специални, избираеми, диференциално диагностични. За култивирането на повечето микроорганизми се използват конвенционални среди, това са месопептонен бульон (MPB), месопептонен агар(MPA), течна мъст, мъст - агар. Специални среди се използват за изолиране, култивиране и идентифициране на определени групи или видове микроорганизми.
Избирателните среди се използват за изолиране на определен вид микроорганизми от техните естествени местообитания и съдържат компоненти, отчитащи биологичните характеристики на изолираните микроби. Например, поради високата си паразитност, дифтерийните бактерии се развиват най-добре върху серумни среди или кръвни среди (Бучина, телурит кръвен агар, коринебакагар). Съставът на средата съдържа калиев или натриев телурит, в резултат на което растежът на свързаните бактерии е силно забавен. За разлика от тях, Vibrio cholerae може да се отглежда дори върху "изгладняла" водна среда, съдържаща само 1% пептон, но pH на средата трябва да бъде повече от 8,0.
Средата за диференциална диагностика (например среда на Hiss, Simons, Clark, бульон на Stern) е предназначена да изследва и показва отделни видове, видове и групи бактерии. Като основа се използват различни органични и неорганични съединения, казеинови хидролизати, пептонна вода, бульон Hottinger-Marten, допълнен с въглехидрати, алкохоли, урея и други вещества; когато се разделят, pH се измества към киселинната (въглехидрати, алкохоли, липиди) или алкална (протеини) страна. Съответно се изолират среди с въглехидрати и алкохоли, среди с урея, среди за определяне на образуването на индол, среди за определяне на протеолитична активност и политропни или комбинирани среди. Различни индикатори (напр. бромотимолово синьо, индикатор Andrede, бромокрезолово лилаво, крезолово червено) също често се добавят към такива среди, за да помогнат визуално да се определи промяната в pH, характерна за различни микроорганизми. По-специално преминаването към киселиннистрана причинява зачервяване на средата с реактива на Андреде или пожълтяване със средата с бромотимолово синьо, докато при алкализиране индикаторът на Андреде и бромотимолово синьо не променят цвета на средата. Всички диференциално диагностични среди са разделени на 4 основни групи.
A. Съдържащи протеини, които дават характерни промени под действието на бактериални ензими (кръв, желатин, мляко и др.); те се използват за определяне на хемолитични или протеолитични свойства. Най-често срещаните среди са NMF, коагулиран конски серум, мляко и кръвен агар (KA).
B. Съдържащи индикатори, въглехидрати или многовалентни алкохоли; ензимното разцепване води до промяна на pH и промяна в цвета на средата. Най-често срещаните са оцветени среди с различни въглехидрати (например с бромтимолово синьо, индикатор за BP) и лакмусово мляко (среда на Minkiewicz). Средите на Хис също се използват широко, които отчитат разликите в способността за ферментация на различни въглехидрати с образуването на киселина или киселина и газ. За диференциацията на ентеробактериите се използва пептонна вода с набор от различни въглехидрати, индикатор Andrede и поплавъци, които улесняват откриването на образуването на газ; в противен случай такъв набор се нарича "пъстра" (или цветна) серия. Най-често използваните въглехидрати са монозахариди (ксилоза, арабиноза, глюкоза, фруктоза, маноза, галактоза), дизахариди (лактоза, захароза), полизахариди (нишесте, гликоген, инулин, декстрин), алкохоли (дулцит, манитол, сорбитол, глицерин) и гликозиди (адонит, инозитол, салицин). ). Например, за изолиране на патогенни бактерии от червата се използват среди, които позволяват диференциране на патогенни микроорганизми от постоянни обитатели на червата - микроорганизми, които разграждат лактозата. Такава средае средата Endo, която включва лактоза. Основните компоненти на средата на Endo са MPA, лактоза и основен фуксин, обезцветен с натриев сулфит. Оригиналната хранителна среда е оцветена в светло розово. Когато лактозата ферментира, се образува ацеталдехид, който реагира със сулфит и оцветява колониите в ярко червено. Следователно E. coli, която ферментира лактозата, когато се отглежда на тази среда, образува червени колонии с метален блясък, докато Salmonella и Shigella са безцветни, тъй като не ферментират лактозата.
B. Среди за определяне на редуциращата способност. Тази група включва среди с багрила, които се обезцветяват при редукция (например метиленово синьо, неутрален червен-Ротберг агар, ин-дигокармин - агар на Омилянски), както и среди с нитрати за определяне на денитрифициращата активност на бактериите (при положителен резултат средата се оцветява в синьо).
G. Среда, съдържаща вещества, които се усвояват само от определена група бактерии. Най-често срещаните среди в тази група са цитратният агар на Simmons и цитратната среда на Coser.
КУЛТИВИРАНЕ И СЪХРАНЕНИЕ НА МИКРООРГАНИЗМИ
Култивирането на микроорганизми, освен от състава на хранителната среда, е силно зависимо от физични и химични фактори (температура, киселинност, аерация, светлина и др.). В същото време количествените показатели на всяка от тях не са еднакви и се определят от особеностите на метаболизма на всяка група бактерии. Съществуват методи за култивиране на микроорганизми върху твърди и течни хранителни среди при аеробни, анаеробни и микроаерофилни условия.
Проблемът с дългосрочното съхранение на микроорганизми се свежда до създаването на условия за суспендирана анимация, т.е. инхибиране на метаболитните процеси. Съхранение на микроорганизмиизвършвани в специални колекции от типови култури. В колекциите жизнеспособността на микроорганизмите може да се поддържа чрез следните методи: 1) периодично повторно засяване (субкултивиране); 2) под минерално масло; 3) сушене; 4) лиофилизация; 5) при ниски и ултраниски температури.