Диагностика на вирусни заболявания по картофите
За диагностика на вирусни заболявания се използват макро- и микроскопски, биологични, физични, химични, индикаторни и серологични методи. Най-често срещаните визуални и серологични методи.
Визуален метод– определяне на заболяването по външни признаци (хлороза, деформации, прекомерно разклоняване, язви, некрози, мозайки) директно на полето (извиване на листата, ивичеста мозайка, бактериоза на стъблата, кафяво бактериално гниене, аукуба - мозайка, набръчкана мозайка, столбур). Този метод често не дава надеждни резултати при откриването на вируси X, S, M, A, които причиняват леки симптоми или са в латентно състояние.
Ефективността на метода за визуална оценка е по-висока, ако се вземе предвид комплексът от основни и второстепенни характеристики в динамиката. Например, слабите признаци на обикновена мозайка се виждат най-добре върху младите растения преди цъфтежа, след което те отслабват или изчезват; усукването на листата се проявява силно по време на пъпкуването, по-късно изчезва; признаци на раирана мозайка се появяват след цъфтежа и се засилват с възрастта на растенията.
Най-типичните прояви на вирусна инфекция по картофите са мозайки, деформации, хлороза, некроза, жълта мозайка.
При тежки форми на вирусни заболявания се отбелязват следните симптоми.
Набръчканата мозайка (вирус Y, често заедно с вируси X, S и A) се характеризира с мозайка и набръчкване на листата, инхибиране на растежа на вените на дяловете по дължина, ръбовете на листата са огънати надолу, има некроза по листата, долните листа изсъхват.
При ивичеста мозайка (обикновено вирус Y) се откриват тъмни петна (некроза) и петна по долната страна на листа, както и по листните дръжки и стъблата.
При усукване на листата (вирус М) се появяватмозайка, извивка и вълнообразност на горните листа, ръбовете на техните дялове са извити нагоре или дяловете са леко сгънати по средната жилка. Симптомите на заболяването са добре разграничени само при млади растения.
Нагънатата мозайка (вирус А) се характеризира с различни деформации на листните дялове, често придружени от мозайки.
Групата на жълтените включва извиване на листа (вирус L): долните листа са усукани в тубули, стават твърди и шумолят, което е особено забележимо по време на цъфтежа.
Петна и обикновена мозайка (вируси X и S) се появяват по листата под формата на размазани светли петна с различни размери, понякога има лека деформация на листата.
хистохимичният анализе приложим за откриване на увреждане на картофено растение от вирус на свиване на листата (откриват се патологични промени в структурата на клетките и тъканите, биохимичния състав на растенията). Във флоема на стъблото се забелязва клетъчна смърт (некроза), а в ситовите тръби на грудките се отбелязва натрупването на калозен полизахарид, открит чрез оцветяване на тъкани с фуксин и резорцинол.
Серологичен метод- откриване на латентна инфекция с помощта на диагностични серуми. Основава се на антигенните свойства на вирусите: при смесване на диагностични серуми със сок от изследвани растения, листа, грудки, кълнове, екстракти от тях, семена, ако са заразени с един или повече вируси, се наблюдава флокулентна утайка. Методът намира широко приложение в първичното семепроизводство и отглеждането на картофи. Позволява да се идентифицират растения, заразени с латентни форми на вируси X, S, M, Y, A и завиване на листата. Оптималното време за анализ за X и M вируси е по време на бутонизация, за Y вирус - 20-25 дни след поникването, а за S вирус - по време на цъфтежа. Препоръчва се серологична оценкапо-малко от 2 пъти. За да направите това, крайните дялове на 3 напълно развити листа (горни, средни и долни) се избират от полски растения и се държат при t 3-5 0 C за най-малко 2 часа, а при анализ на растения, получени от очи в оранжерия, 2-3 листа се вземат изцяло с горната част на стъблото. За да се получат по-надеждни серологични реакции, трябва: 2-3 седмици преди началото на тестовете да се преустановят химическите обработки на посевите, които трябва да се проверят; проверявайте само млади растения; изберете листа от различни нива; вземете сок от прясно набрани листа; между изцеждането на сока и смесването му със суроватка, не допускайте почивка от повече от 30 минути; анализите трябва да се извършват при t 18…22 0 C; съхранявайте смесените капки поне 20 минути.
Разновидност на този метод еензимен имуноанализ,базиран на използването на серуми, чиито глобулини са свързани с ензима (Eliza - тест). Първо, материалът се проверява с капкови серологични, индикаторни и други методи и едва след това този метод се използва за окончателна проверка.
Същността на ензимния имуноанализ е следната: на етапа на изолиране на имуноглобулини се добавя малко количество от ензима пероксидаза или кисела фосфатаза, което позволява рязко повишаване на чувствителността на метода поради цветната реакция. При това се дава не само качествена характеристика, но и количествена. Понастоящем са усвоени методи за получаване на конюгат (имуноглобулини, маркирани с горните ензими) за откриване на вируси X, Y, S, M.
Сред модификациите на ELISA предпочитание се дава на метода на сандвич. Те могат едновременно да идентифицират растенията за инфекция с X, S, M, Y, F, L - вируси.
Оборудване за ELISA: автоматични пипети от 50 до 200 µl, полистиренови плаки с 96 ямки; фотометър, хладилникпри -20 0 С, термостат при +37 0 С, сушилен шкаф, комплекти за диагностика на вируси, които се поръчват от НИИКХ. Анализът се извършва при t 18 ... 25 0 C. Целият процес на определяне продължава 1,5 дни и се състои от следните стъпки:
1. Приложение на антитела. Специфичните антитела се разреждат в буфер и се изсипват в 100 μl (0,1 ml) в ямките на платката, покриват се с капак и се инкубират една нощ при + 40 или 2 часа при + 37 0 C в термостат.
Зачервяване. Разтворът се отстранява от дъската. За да направите това, трябва рязко да обърнете дъската и да разклатите съдържанието. Промийте ямките 3 пъти с промивен буфер. Излишната влага се отстранява от ямките с филтърна хартия.
2. Приложение на анализираните проби. От картофено растение се извлича сок с буфер и 0,1 ml суспензия от изпитвания материал, както и контролни разтвори се изсипват в ямките на дъската. Затворете плаката с капак и инкубирайте една нощ при + 4 0 C или 1 час при + 37 0 C.
Като отрицателна контрола се използва сок от листа или кълнове от очевидно здрави растения и грудки или вместо това в ямката се добавя буфер за проби и конюгат в обем не повече от 0,1 ml (за да се избегне появата на неспецифична реакция).
Приготвяне на пробата. Можете да анализирате листен материал (тръбни растения) или грудкови кълнове (1-2 cm). Натрошената тъкан или изцеденият сок се разреждат с буфер за проби и конюгат в съотношение "тегло:обем" или "обем:обем" - 1:5 - 1:10 на 0,1 ml буфер.
При вземане на проби инструментите и приборите трябва да бъдат добре измити с течаща вода, последвано от дезинфекция.
3. Приложение на конюгата. Изсипете в ямките 0,1 ml от работния разтвор на конюгата (специфично антитяло, белязано с ензим), покрийте плаката с капак, инкубирайте за 1 час при +37 0 C. Промиването се извършва подобно на точка 1.
4.Провеждане на ензимна реакция. Изсипете 0,1 ml от субстрата и инкубирайте при стайна температура 0 за 30...40 минути за оцветяване.
Оценка на резултатите. Наличието или отсъствието на вируса може да се определи визуално или спектрофотометрично. При визуална оценка, която предоставя информация като "да" или "не", интензитетът на цвета в ямките с анализирани проби се сравнява с интензитета на цвета в ямките с отрицателна контрола. Резултатите от анализа могат да бъдат фиксирани със символи:- - няма вирус;+ - материалът е заразен;++ - материалът е силно заразен.
Антителата, нанесени върху таблетка и изсушени на въздух, се препоръчват да се съхраняват при -20 0 С. При тези условия те не губят способността си да взаимодействат с вируса в продължение на няколко месеца.
Контролът на растенията от епруветка по метода Eliza-тест (ELISA) се извършва по време на резници на растения.
За да се получи филм, готовият колодий допълнително се изсушава във вакуум и се разтваря в амилацетат (1-1,5% разтвор).
Върху решетките се поставя филм (3 мм дискове с отвори от мед).
За да се приложи обект върху решетка с филм, се приготвя предметно стъкло с тънка лента от пластир, залепена в средата, от двете страни на която по ръбовете са леко прикрепени 10 решетки с филм.
Контрастирането чрез разпрашване се извършва във вакуумна инсталация. За надеждност се изготвят два препарата на изследвания обект и се разглеждат по 10 полета от всеки препарат. За пръскане се използват метали. Препаратите се разглеждат при увеличение 40-60 хиляди пъти.
Метод на индексиране.Методът на индексиране се използва за откриване на вирусни заболявания през зимата. определяне на инфекцията на клубените с вируси по техните части (индекси). Тя се основава на способността на някоивируси, за да дадат външна проява на заболяването за кратко време в условия на повишена температура. Защо през зимата, след естественото начало на покълването на грудките или изкуствено прекъсване на периода на покой чрез третиране със стимуланти в апикалната част на грудката, се изрязва око (индекс) заедно с пулпа с диаметър до 1,5 см. Индексите се засаждат в саксии с торфени трохи и растенията се отглеждат от тях в оранжерийни условия. В този случай номерът на всяко око (индекс) е същият като този на клонинга, от който е взета грудката за анализ.
При височина на растението 18-20 см растенията се преглеждат внимателно за външни признаци на заболяване. Всички болни растения се отхвърлят и броят им се записва в дневника. Външно здрави хора се проверяват за латентна инфекция чрез серологични или имуноензимни методи. Когато анализирате растения, получени от пъпки в оранжерия, вземете 2-3 цели листа от върха на стъблото. Всички растения с положителна реакция се отхвърлят и броят им се отбелязва в дневника. Според визуални и серологични оценки на растения, отгледани от очи (индекси), клонингите се отхвърлят. Според резултатите от оценката се отхвърлят изцяло всички клонове, чийто брой съвпада с броя на отхвърлените растения в оранжерията.
Задачи за самостоятелна работа.
1. Да се запознаят с методите и техниките за визуална диагностика на вирусни заболявания, които се разглеждат в производството на семена от картофи, и да придобият практически умения.
2. Да се запознаят с методиката и техниката на провеждане на тестове за диагностика на заболявания в латентна форма и да придобият практически умения.
3. Получете практически умения за овладяване на методите на ензимен имуноанализ и метода на индексиране.