Етап 2. Лечение с етанол(диференциация)
1) оцветете с една боя 1) използвайте няколко бои
анилинова серия - основните или тела (основни и спомагателни
кисело: - кисело магента плътни цветове, обезцветени
- еозинови течности (етанол)
- метиленово синьо - метод по Грам
- Петно по Найсер
- тинтява виолет - Ginsa Burri
2) се използват за изучаване 2) се използват за определяне
морфология на микроорганизмите морфология, химичен състав,
структурата на микробните клетки
Най-вече за оцветяване на микроорганизми се използват основни багрила, в които оцветяващият йон е катион.
Багрилото се излива върху повърхността на намазката за определено време, след това намазката се измива, докато струите вода станат безцветни, внимателно се изсушават с филтърна хартия. Ако намазката е правилно оцветена и измита, тогава зрителното поле е абсолютно прозрачно и микробните клетки са интензивно оцветени.
Метод на оцветяване по Грам:
Стъпка 1. Основната боя е генциан виолет, след това разтвор на Лугол. Образува се силно комплексно съединение "генциан виолет + йод". Всички микроби се оцветяват в синьо-виолетово.
Етап 2. Лечение с етанол (диференциране)
запазване на тинтява комплекс губи тинтява комплекс
виолет + йод, не обезцветявайте виолет + йод, обезцветявайте. Това се дължи на факта, че: поради факта, че:
- клетъчната стена е дебела, - клетъчната стена на микробите е тънка,
- съдържа много pep - малко пептидогликан,
- има тейхоеви киселини - няма тейхоеви киселини
- структурата на клетъчната стена - структурата на клетъчната стена
е солидна мозайка, рехава, т.н
образуване, следователно, след третиране с етанол, порите
с етанол, порите на клетката остават същите, боя
стените се стесняват и боята не се измива, микробите се обезцветяват
Етап 3. Магента оцветяване
остават синьо-виолетови, стават червени,
1. Всички коки с изключение на 1. Гонококи и менингококи
гонококи и менингококи
2. Всички спорообразуващи пръчици 2. Повечето неспорообразуващи
3. От неспорови бактерии 3. Спирила
туберкулозен и дифтериен бацил
4. Актиномицети 4. Рикетсии
5. Гъби 5. Микоплазми
Оцветяването по Грам не се използва при изследване на спирохети, протозои и вируси.
Други методи за оцветяване на микроорганизми.
Метод на оцветяване за киселинно-устойчиви бактерии.Киселинно-устойчивите бактерии се дължат на наличието на повишено количество липиди, восък и миколова киселина в клетъчната стена на бактериите. Разтвор на карболова киселина разхлабва клетъчната стена и по този начин повишава нейните тинкториални свойства, а високата концентрация на багрилото и нагряването по време на процеса на оцветяване засилва реакцията на взаимодействие на багрилото с бактериалните клетки, които се оцветяват в червено.По този начин, когато лекарството се третира със сярна киселина, неустойчивите на киселина бактерии се обезцветяват и се оцветяват с метиленово синьо в синьо, а киселинно устойчивите бактерии остават оцветени с магента червено.
Техника на оцветяване по Ziehl-Nielsen
Нанесете карболен разтвор на фуксин върху фиксиран препарат - намазка през лента от филтърна хартия и нагрявайте до появата на пари за 3-5 минути;
Отстранете хартията, изплакнете петното с вода;
Нанесете 5% разтвор на сярна киселина или 3% разтвор на алкохолна смессъс солна киселина за 1-2 минути до обезцветяване;
Завършете намазката с воден разтвор на метиленово синьо за 3-5 минути;
Изплакнете с вода, подсушете, микроскопирайте.
Метод за оцветяване на спориСпорите трудно влизат във физически и химични реакции с различни вещества, включително бои. Следователно, с конвенционалните методи, те не оцветяват, оставайки безцветни вътре в оцветените бактериални тела. За да се оцветят спорите, е необходима специална обработка на петна под формата на предварително нагряване в киселина за омекотяване на черупката или „ецване“ и излагане на концентрирани разтвори на боя при висока температура. В същото време спорите адсорбират боята толкова силно, че не се обезцветяват и стават видими само при допълнително оцветяване с контрастна боя.Така прилаганите методи за оцветяване на спори се основават на следния принцип: първо, целият препарат се оцветява силно, след това се обезцветява частично, като се отнема багрилото от вегетативните тела и се оставя върху спорите, и накрая се оцветяват вегетативните тела в допълнителен контрастен цвят.
Техника на оцветяване по Ожешко
Нанесете 0,5% разтвор на солна киселина върху нефиксирана петна и я загрейте на пламък за 2-3 минути.
Изцедете киселината, изплакнете препарата с вода, изсушете и фиксирайте върху пламъка. След това оцветете по Ziehl-Neelsen. Бактериалните спори стават червени, а вегетативните форми - сини.
Методи за откриване на включвания.Волутиновите зърна са хранилище на хранителни вещества, които са вътреклетъчен резерв от фосфати. Характерна особеност на волютина е способността му към метахромазия, т.е. боядисване в цвят, различен от цвета на багрилото.Така зърната на волютин сасъединения, които за разлика от цитоплазмата имат алкална реакция и следователно селективно възприемат син ацетат, превръщайки се в тъмно син. Цитоплазмата на клетката, която има кисела реакция, възприема алкалното багрило везувин и оцветява в жълто.
Метод на оцветяване по Leffler (прост метод)
Оцветете фиксираното петно с метиленово синьо за 3-5 минути.
Изплакнете с вода, подсушете и микроскопирайте.
Волутиновите гранули изглеждат червено-виолетови на синия фон на цитоплазмата.
Метод на Найсер (комплексен метод)
Нанесете син ацетат на Neisser върху фиксирана петна за 2-3 минути.
Добавете разтвор на Лугол за 10-30 сек.
Изплакнете намазката с вода.
Завършете намазката с воден разтвор на везувин или хрезоидин за 0,5-1 min.
Изплакнете цитонамазката с вода, подсушете и микроскопирайте.
Метод за откриване на капсула.Много микроорганизми имат капсула, която обгражда микробната клетка под формата на слузест слой. Капсулите могат да бъдат с различни размери и химичен състав. По-често те се състоят от полизахариди с високо молекулно тегло, по-рядко включват протеини. Основната функция на капсулите е защитна.Капсулите не приемат багрила с конвенционални методи на оцветяване. За идентифицирането им се използва методът Burri-Gins.
Метод на оцветяване на Burri-Gins (комплексен метод)
Смесете капка суспензия от микробни клетки с капка мастило и използвайте чаша с шлифован ръб, за да направите петно по същия начин като кръвно петно, изсушете и фиксирайте.
Нанесете воден разтвор на фуксин върху намазката за 1-2 минути.
Изплакнете с вода, изсушете на въздух и микроскопирайте.
Бактериите са оцветени в червено, а неоцветените капсули се открояват в контрастчерно-розов фон.
Методи, използвани за изследване на местни лекарства:
Метод на смачкани капки.Капка тестов материал или суспензия от бактерии се нанася върху повърхността на обезмаслено предметно стъкло и се покрива с покривно стъкло. Капката трябва да е малка, да не излиза извън ръба на покривното стъкло. Пробата се микроскопира с 40x обектив.
Метод на висящи капки.Препаратът се приготвя върху покривно стъкло, в центъра на което се нанася една капка бактериална култура. След това предметно стъкло с отвор, чиито краища са предварително смазани с вазелин, се притиска към покривното стъкло, така че капката да е в центъра на отвора. Бързо обърнете образеца с главата надолу с покривното стъкло. При правилно подготвен препарат капката трябва да виси свободно над кладенеца, без да докосва дъното или ръба му. За микроскопия първо се използва сух 8-кратен обектив, под чието увеличение се открива ръбът на капката, след което се поставя 40-кратен обектив и се изследва препаратът.
Интравитално (жизнено) оцветяванеКъм капка 0,001% разтвор на метиленово синьо или неутрално червено се добавя суспензия от микроорганизми. След това се приготвя "висящ" или "натрошен" капков препарат и се микроскопира. След микроскопиране препаратите от „висяща“ или „натрошена“ капка се потапят в дезинфекционен разтвор.
Самостоятелна работа след учебни часове
1. Дефинирайте:
а) морфологични свойства - __________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ б) тинкториални свойства - ____________________________________________________