Флуоресцентна микроскопия Засега сме навсякъдеизползва метричната система от единици
Досега използвахме метричната система от единици навсякъде. Нека въведем още един нов термин от тази система – нанометри.
Има 1000 микрона в един милиметър и 1000 нанометра в микрон. Тоест в един метър има милиард нанометра.
В миналото всички флуоресцентни микроскопи работеха в пропускаща светлина с кондензатори, изискващи потапяне при 20x увеличение или повече, и с мощни източници на светлина (до 200 W).
Ориз. 11. Флуоресцентен микроскоп с цифрова камера
Впоследствие са разработени специални багрила, които при възбуждане от светлина дават флуоресцентно сияние на лекарството, което обаче бързо избледнява под действието на вълнуващите лъчи. Флуоресцентната микроскопия обикновено се извършва в тъмни стаи поради ниската осветеност на изображението и бързата фотохимична промяна (прегаряне).
Теснолентовите филтри се използват за възбуждане на флуоресценцията. Така например, за да възбудите флуоресценцията на препарати, оцветени съгласно FITC (максимум на възбуждане при дължина на вълната 495 nm), се използва светлинен филтър с полуширочина на пропускане 10 nm, т.е. той предава спектралната област от 485-505 nm. Когато светлината преминава през оцветен препарат, частта от препарата, която е адсорбирала багрилото, флуоресцира.
 |
Блокиращите филтри, монтирани в пространството над лещата, абсорбират вълнуващите флуоресценцията лъчи, предпазват очите ви и ви позволяват да видите радиацията само от частта от препарата, която флуоресцира.
Тъй като има много багрила, обичайно е да се използва въртящ се барабан с 4, 5 или 6 филтъра за възбуждане, предназначени да възбуждат светлина със специфични дължини на вълната. Блокиращите филтри също се различават, въпреки че постепенно станахаизползвайте само два основни филтъра. Получаването на осветлението, необходимо за този метод, стана възможно чрез използването на мощни 200 W живачни лампи. След включване вътре в такава лампа се създава налягане от 14 или 15 атмосфери. Използването на тези дъгови лампи е опасно, така че при смяната им трябва да се носят очила.
Има много проблеми с този метод. Основните са: много лекарства имат собствена луминесценция, която понякога е трудно да се различи от флуоресценцията, причинена от цвета; в допълнение, интензитетът на флуоресценция на лекарствените структури бързо намалява под действието на вълнуващи лъчи, което пречи на наблюдението и особено на фотографирането на лекарствата.
Тъй като този метод се използва в медицината за диагностициране на заболявания и определяне на тяхната тежест, тълкуването на изображението на лекарството стана изключително важно.
Когато Leitz предложи използването на отличен сух кондензатор с тъмно поле с висока пропускливост на светлина, но сив фон, никой не беше сериозно заинтересован. Всеки би трябвало да бъде научен как да тълкува цвят, който контрастира със сив фон вместо черен, а това от своя страна би причинило много проблеми, въпреки че би позволило да се използва много повече светлина, което беше толкова необходимо!
Проведени са и експерименти с различни неживачни лампи: ксенонови, халогенни, въглищни и др. с мощност до 450 W. Стойността на лампата се определя в зависимост от дължините на вълните и яркостта на тяхното излъчване. Въпреки това, за да се използват такива източници на светлина, ще са необходими доста скъпи трансформатори с висока мощност.
Не забравяйте, че флуоресцентният микроскоп се използва за установяване на първичната медицинска диагноза и че промяната на напрежението в лампата променя цвета на флуоресценцията на лекарството.Разработени са нови регулатори на напрежението, за да се намали вероятността от грешка, но микроскопите станаха още по-скъпи.
Тогава някой (вероятно Leitz) е проектирал флуоресцентен осветител, който да работи при падаща светлина. (За първи път принципът на работа на флуоресцентен микроскоп в падаща светлина, използващ дихроични разделители на лъчи, беше предложен през 1948 г. от съветския учен Е. М. Брумберг. - Ред.) Този осветител се състоеше от източник на светлина, колектор и специален непрозрачен осветител, в който бяха вмъкнати взаимозаменяеми кубични блокове с възбуждащи и блокиращи филтри и разделител на смущения (дихроично огледало). . Това даде възможност да се увеличи осветеността на флуоресцентното изображение и по този начин направи възможно използването на по-малко мощни живачни лампи (50 или 100 W); освен това беше възможно да се получи по-контрастно изображение.
Благодарение на специалните блокове за обикновени и специални багрила, работата стана по-обикновена и проста. Някои микроскопи имат място за два блока с фиксиране на позицията на всеки; други инсталират 4 или дори повече блока. Днес обикновено се използва комбинация от флуоресцентна микроскопия с фазов контраст. Методът се свежда до включване на двата осветителя и до затваряне на препарата от епиосветление. Проверете микроскопа, като използвате техниката на Koehler, ако е необходимо. Фокусирайте се върху слайда в светло поле или предаван фазов контраст, за да намерите областта на интерес в слайда. Блок
предавана светлина, деблокирайте светлината, която възбужда флуоресценцията, и използвайте блока с необходимите филтри, за да изследвате препарата и да направите снимки, ако е необходимо.