Флуориметрия. Част от неписан учебник на агроном
Така че ние се гмуркаме в техника, която току-що се появява за практическа употреба в полетата: имате проблем, растенията са слаби, състоянието им е под нормалното. Взимате - или по-скоро в ръката ви, той се побира в едната ръка - флуорометър и след няколко минути получавате отговор какъв ви е проблемът. И може би все още може да се поправи.
Нека разгледаме по-подробно механизма на този метод.
Два вида устройства за моментален анализ на състоянието на завода
Хлорофилна флуоресценция: полезен (практичен) инструмент
Катедра по физиология на растенията, Варшавски селскостопански университет SGGW Уляницкая
Продължаваме запознаването си с флуорометрията. Методът, който определя фотосинтетичната активност на растението и следователно неговия бъдещ добив, не е съвсем прост на теория, като разбиране, но е много прост като приложение. Основните му предимства са простота и бързина. Не е необходимо да вземате проби на полето, да изваждате растения или части от тях или да ходите в лабораторията.
Всички най-сложни анализи могат да бъдат извършени от всеки на терена. И отнема много малко време: едно типично измерване трае една секунда, но предоставя много информация. Трудно за вярване, нали? Какво може да улови устройството за толкова кратко време?
Флуорометърът, чиято работа се основава на измерване на интензитета на флуоресценция (светене) на хлорофила, улавя интензитета на не постоянна, а краткотрайна флуоресценция, която се наблюдава при интензивно осветяване на растението след затъмняване. Тази скорост на получаване на резултат ви позволява да изследвате стотици растения на час. Много животновъди вече са използвали този метод в своите изследвания като критерий за развъждане.селекция и потвърди, че предоставя надеждна информация за фотосинтезата, която е пряко свързана с крайния добив на културата. В допълнение към интензитета на отражението на хлорофила, флуориметърът записва много други параметри, които могат да се използват като допълнителни или верифициращи надеждни индикатори. Целта на статията е да говорим за тези параметри, така че умело да използвате получените знания, за да постигнете целите си.
Измервания на флуоресценция на хлорофил
Хлорофилът, зеленият пигмент в растенията, участва пряко в няколко физиологични процеса. Чрез изучаване на неговата флуоресценция, ние индиректно изучаваме други нива на фотосинтеза (напр. процеси на ниво пигмент, тилакоидни първични светлинни реакции, реакции на движение на електрони, тъмни ензимни реакции, бавни регулаторни процеси). Тези показатели често са определящи за физиологичното състояние на растенията. Проявата на влиянието на стресовите условия в растенията се случва на етапа, когато повечето физиологични процеси вече са необратими. В предишната статия многократно беше споменато, че фотосинтезата е най-добрият индикатор за определяне на състоянието на растението на клетъчно ниво. Факт е, че процесът на фотосинтеза често се забавя в растенията, изложени дори на краткотрайни неблагоприятни условия - недостиг на вода, температура, липса на хранителни вещества, конкуренция на плевелите, проникване на патогени (Araus et al., 1998). Следователно, анализът на параметрите на флуоресценцията на хлорофила се счита за важен метод за оценка на здравето, вътрешната цялост на растението в рамките на надземната част на културата (Krause and Weiss, 1991; Clark et al., 2000). Освен това е бърз и точен начин за диагностициране и определяне на степента на устойчивост на растенията към неблагоприятни илистресови състояния (Li et al., 2006). Освен това, ново направление във физиологията на растенията (изследване на междуклетъчната комуникация на невроните) показа, че измерването на интензитета на флуоресценцията на хлорофил е един от най-обещаващите методи за определяне (идентифициране) на растителни видове и може също да се използва за определяне на състоянието на растенията без наличието на каквато и да е първична информация (Codrea et al., 2003). Флуорометърно изображение на кривата на интензитета на флуоресценцията на хлорофила ще помогне да се разберат промените, които настъпват в растението (Lawson et al., 2002; Moya and Cerovic, 200).
Флуоресценцията на хлорофил не е много сложен феномен. Същността му се крие в способността на зеления пигмент - хлорофила - да абсорбира и след това да излъчва (отразява) светлинна енергия и дълги дължини на вълните на светлината. Продължителността на такова излъчване от хлорофил се определя от два фактора: количеството светлина, погълнато от растението, и нивото на конкуренция за светлинна енергия с други енергийни процеси, които се случват в растението (главно това са процесите на образуване на нови вещества и пренос на топлина в растението). Ако хлорофилът започне да абсорбира светлина по-малко, тогава неговите конкуренти получават повече светлинна енергия. Следователно промените в интензитета на флуоресценцията отразяват промените в ефективността на производството на нови вещества - бъдещето на нашата култура (Hnstch, 2007). Схематично това може да се покаже по следния начин (фиг. 1). През последните десетилетия развитието на електрониката допринесе за появата на достъпни за мнозина инструменти за измерване на хлорофилни флуоресцентни сигнали от всяка част на растението, в която протича фотосинтеза. Нека се запознаем с тях по-подробно.
Първи тип - продължителна индукция (стимулиране) на хлорофил
дългосрочен флуорометърстимулацията е предназначена да измерва интензитета на луминесценцията на хлорофила, която се появява след краткотрайна липса на светлина. Физиолозите наричат този процес индукция на бърза флуоресценция или индукция на Кауцки, на името на учения, който изследва това явление още през 1931 г. (Kautsky and Hirsch, 1931). Преди това, за изследване на пробата, растенията бяха покрити със специален екран, който не пропуска дълги (червени) дължини на вълната на светлината. Изследванията са проведени в стая, оборудвана със специални лампи със зелена светлина, след като растенията са били на тъмно в продължение на няколко минути. Сега с помощта на флуориметри измерванията могат да се правят на полето, като се прикрепят сензори със скоби към всяка (която ви интересува) зелена надземна част на растението. На екрана на флуориметъра се появяват различни цифри, букви, графики, които на пръв поглед не ни казват нищо за растението (фиг. 2).
Но това е само на пръв поглед. Оказва се, че с помощта на такъв флуориметър можем да измерим няколко метрични показателя.
Първият индикатор - нивото (интензивността) на освобождаване на светлинни вълни от хлорофила - се обозначава със символа Fo.
Параметърът Fo показва каква част от погълнатата преди това светлина се излъчва от молекулите на хлорофила. За да се фиксира това ниво, е необходимо в растителните клетки да протече сложна реакция - окисление на първия стабилен акцептор на електрони на фотосистемата, наречен Qa. С други думи, необходимо е тези молекули, които получават светлинни вълни в растителните клетки, да се комбинират с молекулите на кислорода и да започнат да пренасят светлинна енергия към други клетъчни молекули, които ще започнат да излъчват тази светлина от клетката. (Всеки е запознат с подобно явление - спомнете си как устройства, играчки, ключодържатели и др., които имат в състава си бял фосфор, светят в тъмното. Принципът ерастението е същото.) Окислителната реакция протича моментално, дори по-бързо, отколкото четете тези редове – няколко наносекунди (една милиардна от секундата). И всичко се фиксира от флуориметъра, което потвърждава неговата висока чувствителност. Интензитетът на Fo се променя с времето.
Вторият индикатор - максималното ниво на излъчване на светлина от хлорофил - се обозначава със символите Fp или Fm.
Това е параметър, който показва максималното ниво на флуоресценция за определен период от време. На устройството се обозначава с един от символите: Fp или Fm. Защо така? Всичко е много просто. В зависимост от времето на измерване, молекулите, които получават светлинни вълни, имат време или, обратно, нямат време да се свържат напълно с кислорода. Ако молекулите са успели да абсорбират всички необходими светлинни вълни и напълно да се комбинират с молекулите на кислорода, тогава на екрана се появява символът Esh, максимално възможното ниво на флуоресценция на хлорофила за изследваното растение. Ако по време на измерването времето не е много слънчево или интензитетът на светлината не е достатъчно висок и растението не може да бъде напълно наситено с кислород по време на измерването, тогава на екрана на устройството се появява стойността на Ep, максималната интензивност на флуоресценция за периода на измерване.
Третият индикатор е Fv.
Параметърът Fv е временна стойност и се изчислява от флуориметъра като разлика между първите два показателя, т.е. максималното възможно ниво на флуоресценция на хлорофил се изважда от нивото на флуоресценция на хлорофил на растението.
Четвъртият показател е съотношението Fv/Fm.
Fv/Fm е параметър, който се използва широко за оценка на максималното ниво на фотосинтеза за това растение. Ясно показва наличието на стрес в растението. как? Здрави растения без стреспри оптимални условия, като правило, имат съотношение Fv / Fm приблизително 0,85. Ако този показател е по-малък, растението се влияе негативно от външни фактори. Този показател може да се използва и за оценка на нивото на стрес.
Петият индикатор е Tfm.
Tfm е параметър, показващ времето, през което е достигнато максималното ниво на флуоресценция (Fm). Ако растението е в стресови условия, Tfm е под оптималното време.
Шестият показател е индексът на продуктивност на растенията - Р1.
Индексът на продуктивност (P1) по същество е индикатор за жизнеспособността на растението. Това е общ показател за устойчивостта на растението към влиянието на отрицателните условия (неблагоприятни, ограничаващи) на външната среда. Показва доколко растенията от дадена култура могат да се справят сами със стреса, променяйки или поддържайки продуктивността си.
Флуорометрите, които работят на принципа на измерване на интензитета на краткотрайната флуоресценция на хлорофила, се наричат "метри на стреса на растенията". Обикновено тези инструменти са преносими, леки и със софтуер за допълнителен анализ на получените параметри. Като пример - джобен флуориметър за хлорофил REA (снимка 1).
Вторият тип е устройство със система за модулация на светлинен сигнал (импулс).
Едно от най-значимите предимства на такива флуориметри е възможността за изследване на растения при всякакви метеорологични условия директно на полето. Устройството фиксира индексите на флуоресценция на хлорофила при естествена светлина, която е оптимална за растението, и ако светлината не е достатъчна, той самостоятелно симулира необходимия сигнален импулс, който замества необходимото ниво на светлина. С помощта на такива флуориметри е възможно да се симулира максималната възможна продуктивност на културата вналичните условия на вашата област. В допълнение към показателите за интензивността на флуоресценцията на хлорофила, продуктивността на растенията, флуориметърът записва и други показатели. Типичен пример е показан на фигура 3.
Fo е нивото на флуоресценция на растението.
Fm - максимално възможното ниво на фотосинтеза за изследваната растителна проба.
F е нивото на флуоресценция, наблюдавано по всяко време през дневните часове.
F'm е максималното ниво на флуоресценция при наличие на светлина.
F'o - минималното ниво на флуоресценция от растението при липса на светлина.
ML е количеството светлина.
SP - нивото на насищане на растението със светлинни вълни.
AL е нивото на светлина, което се използва при фотосинтезата.
FR е далечна червена светлина, която не участва във фотосинтезата (van Kooten and Snel, 1990).
Устройствата за измерване на флуоресценцията на хлорофил от този тип се наричат флуориметри със система за модулация на светлинния сигнал. Типичен пример е флуорометърът за хлорофил FMS-2 (основната снимка на статията).
Какво могат да открият флуорометрите?
Според Strasser et al.(2000) има четири основни набора от въпроси, на които може да се отговори с помощта на флуориметри.
Тип 1 - наличие на химичен стрес.
Има стабилни показатели за нивата на фотосинтезата при определени условия: ефектът от излагане на химикали за алелопатия (отделяне на други растения - култури или плевели), хербициди, регулатори на растежа, торове, CO2, O2, SO2 или други газове и др.
Тип 2 - наличие на физически стрес.
Флуорометърът сравнява показанията със стабилни стойности при различни условия на интензитет на светлината или температура.
3 тип - наличие на смесен химически и физически стрес.
4-ти тип - биоизследване.Те се извършват постоянно с определен интервал от време с цел:
- изучаване на реакцията на растенията (или дори растителна общност) във времето по отношение на тяхната жизнеспособност, продуктивност и реакция на стрес;
- изследване на връзките структура-функция в трансгенни растения.
Както точно отбеляза канадският учен биоинженер Щрасер, флуориметрите са уникални устройства, които позволяват да се определят много биологични показатели не само за учените, но и за всеки заинтересован човек. С флуорометър можете да получите информация - от определяне на селскостопанската продуктивност на растенията от всяка култура, като се вземе предвид влиянието на вида на земеделието, хербицидите, пестицидите, регулаторите на растежа, сортовете, факторите на околната среда, които могат да причинят стрес, и завършвайки с изследването на влиянието на глобалните климатични промени.
Бързо, лесно и достъпно
За подробна картина и консолидиране на знанията, на вас, читателя, ще бъдат предложени още пет статии с подробни теоретични изчисления и практически инструкции за използването на флуориметрия и флуориметри в практиката на агробизнеса.