ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА ГАНГЛИИТЕ И ТЕХНИТЕ ПРОЦЕСИ
Сред методите за импрегниране с метали първо място заемат методите за импрегниране със сребро на Голджи. Те се основават на образуването на сребърни съединения, които се отлагат върху отделни ганглийни клетки и техните процеси, а често и върху глиални клетки, съдове и други образувания. Най-разпространен е така нареченият бърз метод на Голджи. В много случаи вместо това може да се използва простият метод на сребро на Шулце. Недостатъкът, но в същото време и предимството на метода на Голджи е, че импрегнирането никога не обхваща всички клетки, а е ограничено до отделни елементи. Благодарение на това се получава картина, макар и не пълна, но по-ясна, отколкото ако всички клетки са идентифицирани.
Методът на Голджи е от голямо значение не само за импрегнирането на нервните клетки, но и за откриването на нервни окончания, секреторни капиляри, жлезисти пасажи, клетъчни граници и др. Въпреки че методът на Голджи предоставя само сянка, в подходящи случаи с негова помощ успешно се разкриват различни тъканни елементи. При използването му, разбира се, винаги трябва да се знае, че откриването на структури се основава на образуването на утайка, която при определени обстоятелства може да даде картина на структури, които всъщност не съществуват. Трябва също да се има предвид, че идентифицираните клетки или структури може да са непълно импрегнирани. Кои образувания ще бъдат импрегнирани е до известна степен въпрос на случайност, тъй като условията, при които се получава образуването на утайка, за съжаление, все още не са достатъчно известни. В тази връзка са необходими знания и опит за правилната оценка на получените резултати.
Ускорен метод на Голджи
1.Парчета тъкан, ако е възможно пресни, се поставят в смес от 40 ml 2,5% (до 3,5% Cajal) калиев дихромат и 10 ml 4% осмиев тетроксид при 20-25 ° C в кафява бутилка върху стъклена вата, така че течността да проникне от всички страни. Посоченото количество течност е достатъчно за 5-6 бр. Парчетата не трябва да са твърде големи или твърде малки (дебелина 2 - 3 mm, повърхност 5 - 10 mm2).
Продължителността на експозицията не може да бъде определена предварително, тъй като тя е различна за всеки обект, следователно голям брой парчета винаги се поставят в сместа и се изваждат от разтвора за 2–7 дни на интервали от около 12 часа.
2. Парчетата се изсушават с филтърна хартия и се потапят в малко количество 0,75% разтвор на сребърен нитрат, който, ако е необходимо, се променя няколко пъти, докато утаяването спре, след което се поставят за 1-2 дни (за 1-6 дни според Ramon y Cajal) в 100 ml 0,75% разтвор на сребърен нитрат при стайна температура или 35 ° C (не по-висока), за предпочитане на тъмно.
3. Измива се в 40% спирт (1-2 часа), като се сменя няколко пъти. Прехвърля се към 80% и 96% алкохоли. След това парчетата се притискат в уплътнения черен дроб или се залепват с гума арабика и се нарязват с бръснач или на микротом, намокрен със спирт (дебелина на среза 20-100 микрона). Ако парчетата след пресоване в алкохол се прехвърлят обратно във вода, тогава те също могат да бъдат нарязани на микротом за замразяване. Парчетата могат също така бързо да се изсипят в целоидин, за което се дехидратират в 100% алкохол за 12 часа, алкохол-етер 2-4 часа, 4% целоидин 1-2 дни, поставят се върху дървен или по-стабилен блок, заливат се с гъст разтвор на целоидин и се уплътняват на въздух или в 80% алкохол. Ако тъканта се разпада силно по време на рязане, тогава блокът се смазва с течен разтвор на целоидин след всяко рязане.
Парчетаможе също да се постави за 1-4 часа в 100% алкохол, за 1 час в смес от 100% алкохол и етер (1:1), а след това за няколко часа в течен целоидин (в съд с хлабава запушалка). След това обектът се уплътнява в хлороформени пари и се нарязва в 96% алкохол.
Срезовете се измиват старателно в 80% алкохол, за да се отстрани излишното сребро, дехидратират се в абсолютен алкохол, изчистват се в креозот и след това в терпентин.
След това срезовете се прехвърлят върху покривно стъкло, маслото се изсмуква внимателно и се нанася капка плътен балсам, който се разпределя по целия препарат. В този вид препаратът се оставя да съхне няколко дни на защитено от прах място и накрая покривното стъкло се фиксира с разреза надолу върху перфорирано предметно стъкло или дървена дъска. По този начин препаратът не трябва да се затваря между предметното стъкло и покривното стъкло, тъй като в този случай импрегнирането се разрушава за кратко време.
Резултат: при успешно импрегниране отделни тъмно черни ганглийни клетки заедно с израстъци се открояват на светъл фон.
Ганглийните клетки се импрегнират най-лесно върху материал, взет от млади животни (късни ембриони, животни на възраст 1-10 дни). Особено благоприятни обекти са мозъкът и гръбначният мозък на пилетата на гълъбите.
Продължителността на хромирането оказва силно влияние върху резултатите. За съжаление е невъзможно да се дадат точни препоръки, тъй като е различно за всеки обект и зависи от състоянието на лекарството, температурата, концентрацията, количеството течност и т.н. Сроковете са определени чисто емпирично: за ганглийните клетки на централната нервна система обикновено 3-5 дни, за глията 2-3 дни, за нервните влакна 5-7 дни. Ако хромирането е твърде кратко, се появява само дифузна утайка от сребърен хромат, ако е твърде дълго, те намиратсамо рязко ограничени кристали, импрегниране липсва.
Парчетата тъкан обикновено са заобиколени от дебел слой сребърни отлагания, което може да затрудни наблюдението, особено в случай на препарати с тънка мембрана, тъй като покрива по-голямата част от препарата. В тази връзка, преди да поставите парчетата в разтвор на сребърен нитрат, е препоръчително бързо да ги потопите няколко пъти в 10% разтвор на желатин, т.е. заобиколете с желатин. След посребряването желатинът се освобождава чрез бързо потапяне на парчетата в топла вода, наситена със сребърен хромат.
Предмети, които са били твърде дълго в разтвори, съдържащи хром, все още могат да бъдат подходящи за импрегниране на Golgi, ако бъдат третирани в продължение на 1-14 дни в често сменяна смес от равни части от 2-3% разтвор на калиев бихромат и 4-5% разтвор на меден сулфат; от тази смес обектът се прехвърля във вана със сребърен нитрат.
Надеждността на метода на Голджи се повишава чрез 2- или 3-кратно импрегниране на Cajal. Благодарение на това често е възможно да се "спаси" импрегниране, което се оказа неуспешно за първи път.
При повторна импрегнация продължете както при използване на метода на Голджи (бързо). Парчето се изсушава върху филтърна хартия и се поставя в предварително използваната смес от калиев бихромат и осмиев тетроксид и след това за 1 ден в използвания по-рано разтвор на сребърен нитрат. Изплакнете с дестилирана вода, изсушете с филтърна хартия. Потапя се за 1-2 минути в 96% спирт, подсушава се с филтърна хартия. Направете блокче с гума арабика или парафин и изрежете, намокряйки с 96% спирт. Дебелина на сечението 80-100 микрона; срезовете се измиват в 96% спирт, подменят се 5-6 пъти, общо не повече от 30 минути. Прехвърля се върху предметно стъкло, притиска се с филтърна хартия и се заключава (според метода на Голджи).Горните процедури могат да се повторят за 3-ти път.
Бавен метод на Голджи
Малки парчета органи се поставят в течност на Мюлер или 3% разтвор на калиев дихромат, чиято концентрация постепенно се повишава до 5% (в кафяв стъклен съд). След 4 - 6 седмици се прави първият тест; за това едно парче се изсушава с филтърна хартия, изплаква се в 0,75% разтвор на сребърен нитрат и след това се поставя в същия разтвор в продължение на 24 часа.Ако не се установи импрегниране върху разрезите, направени с бръснач от материала, тогава тестът се повтаря след 8 дни. След импрегниране материалът се обработва по метода на Голджи, като се започне от точка 3.
Специални техники за импрегниране на нервни клетки с процеси и контактен апарат
Оригинална техника на Голджи
Тази техника е основната в изследването на фините структурни характеристики на дендритите, шиповете и аксоналната система на невроните; позволява по-пълно разкриване на морфологичните характеристики на невроните и междуневронните връзки.
1. Части от мозъчна тъкан се фиксират в 10% формалин за 1 до 15 дни. Увеличаването на продължителността на фиксиране във формалин влошава качеството на импрегнирането. Дебелината на парчетата не трябва да надвишава 3 - 3,5 мм.
2. Парчетата, фиксирани в 10% формалин, се прехвърлят (без измиване) за 3 дни в течност на Мюлер в термостат.
3. Поставете (без измиване) във фиксатор, състоящ се от 5 ml 1% осмиев тетроксид и 25 ml 3% калиев бихромат, който се приготвя непосредствено преди употреба, поставете бутилката със смлян капак за 2 дни в термостат при температура 37 ° C. За фиксиране на едно парче са необходими поне 30 ml от тази смес.
4. Измийте парчетата в 2 смени на 1% разтвор на сребърен нитрат, приготвен с 20% разтвор на глюкоза.
5. Парчетата се прехвърлят в буркани от тъмно стъкло върху стъклена вата и внимателно се налива разтвор на сребърен нитрат върху глюкоза (около 40-50 мл разтвор на 1 бр.). С парчетата трябва да се работи много внимателно: можете да ги вземете само с пластмасова или стъклена шпатула, не трябва да използвате метална шпатула. Парчетата се импрегнират за 14-20 дни на топло място.
6. Прекарайте алкохоли с нарастваща концентрация:
|