РНК и ДНК анализ
МатериалиВсички реагенти трябва да са без РНКаза или третирани с DEPA. • 6 M глиоксал: глиоксалът обикновено се доставя като 40% (6 M) разтвор. Тъй като глиоксалът се окислява бързо във въздуха, преди употреба той се дейонизира с помощта на катионобменни и анионобменни смоли (например Bio-Rad AG 501-X8), като глиоксалът се смесва заедно със смолите в орбитален шейкър, докато се достигне рН по-малко от 5,0.Дейонизираният глиоксал се съхранява излят в аликвоти в плътно затворени епруветки при -20 ° C. Епруветките трябва да се напълнят възможно най-пълно и всяка аликвотна част трябва да се използва само веднъж • DMSO: Обикновено висококачественият DMSO може да се използва така, както се доставя от компанията, без допълнителна обработка. Въпреки това, бутилка пресен DMSO е най-добре да се раздели на аликвотни части и да се съхранява при -20 ° C. Всяка аликвотна част трябва да се използва само веднъж • 10 x буфер за електрофореза: 100 mM натриев фосфатен буфер, pH 7,0 • Смес за денатурация: 3 ml 6 M глиоксал, 7,5 ml DMSO и 1,5 ml 10 x буфер за електрофореза Тази смес се съхранява в други квоти в плътно затворени епруветки при -20 C. Епруветките трябва да бъдат почти напълно напълнени и използвани само веднъж • Буфер за приложение: 50% глицерол, 0,25% бромофенол синьо в 1 х буфер за електрофореза • Агароза (за електрофореза)
Метод1. Разтворете всяка РНК проба (съдържаща приблизително 20 µg РНК) в 3 µl обработена с DEPA вода и добавете 12 µl денатурираща смес. 2. Денатурирайте РНК чрез нагряване при 50 °C за 1 час 3. Приготвя се 1.1% (w/v) агарозен гел в 1 х буфер за електрофореза и се охлажда до 70° С. За да се инактивират RNases, сух натриев йодоацетат се добавя към гела до крайна концентрация от 10 тМ. 4.Охладете сместа до около 50°C, изсипете в кювета и оставете за 30 минути на стайна температура.
5. Добавете 2,5 µl зареждащ буфер към всяка РНК проба, разбъркайте внимателно и бързо центрофугирайте в микроцентрофуга при 12 000 g. 6. Поставете проби в ямки с агарозен гел и извършете електрофореза при градиент от 1-2 V/cm в 1 х буфер за електрофореза. По време на електрофорезата буферът трябва да се рециркулира, така че неговото pH да се поддържа на 7,0, тъй като при pH 8,0 комплексът глиоксал/РНК се дисоциира. 7. Когато бромофеноловото синьо достигне края на гела, електрофорезата се спира и гелът се оцветява с етидиев бромид (0,5 μg/ml в 25 mM Tris-HCl, pH 9,0) в продължение на 1 час с леко разклащане. При силно фоново оцветяване излишъкът от етидиев бромид може да се измие с вода (две смени по 30 минути). 8. Гелът се разглежда в UV трансилюминатор и се снима с камера Polaroid.
- Важно е напълно да денатурирате РНК преди електрофорезата и да я поддържате по време на електрофорезата, тъй като електрофоретичната подвижност на РНК се променя с образуването на вторичната структура. За да бъде електрофорезата успешна, при приготвянето на денатуриращата смес се използват висококачествени реагенти и е необходима постоянна циркулация на буфера по време на електрофорезата. - Глиоксалът реагира с етидиев бромид, следователно това багрило не се използва при приготвянето на гела и електрофорезата. - За интактни РНК препарати интензитетът на флуоресценция на лентата 28S-РНК трябва да бъде поне два пъти по-висок от този на лентата 18S-РНК.