2 Автофлуоресцентна диагностика на онкологични заболявания на ларинкса и фаринкса
За поставяне на оптичната сонда в кухината на ларинкса е разработено ларингеално прикрепване към световода (4) с дисталния край на оптичния сензор. Дюзата представлява куха метална тръба с диаметър 0,4-0,6 см с дръжка-държач, през която минава световода. Краят на тръбата е огънат на разстояние 4-5 см от работния край под ъгъл 100-110 градуса, което съответства на анатомичната форма на ларинкса. Важно е също, че накрайникът може да се стерилизира и в резултат на това да се използва многократно при различни пациенти (5).
Режимите на работа на спектралния анализатор, регистрацията и натрупването на спектри се контролират с помощта на софтуер, работещ под операционна система Windows. Спектрограмите на всеки пациент се съхраняват в компютърно базиран архив (8).
За да се получат неизкривени спектри, преди началото на експериментите, инструментът беше калибриран за спектрална чувствителност и калибриране на дължината на вълната с помощта на стандартни спектрални източници.
Изследвания in vivo, които се състоят в записване на спектрите на автофлуоресценция на неоплазми на лигавицата на ларинкса и орофаринкса, са проведени на базата на KB SGMU на името на A.I. С.Р. Миротворцев, Саратов, съгласно протоколите, препоръчани от комисията по етика на Саратовския държавен медицински университет.
По време на серия от измервания, постоянен (спрямо контролната проба) интензитет на азотния лазер беше зададен равен на 1600 относителни единици.
Спектрите се записват при директен контакт (докосване) на светлинния водач с повърхността на лигавицата под ъгъл 90%. По този начин се извършва процесът на точково сондиране на неоплазмата илигавица по периферията. За изследването са избрани три зони: централната част на неоплазмата; периферията на неоплазмата (зоната на визуалната граница със здрава тъкан); видимо непроменена тъкан (здрава). За всяка локализация са извършени 3-4 измервания, получените данни са осреднени.
За да се избегнат болката и рефлексите на повръщане при пациентите, изследванията са проведени при локална анестезия (лидокаин 10%).
Тъй като спектърът на автофлуоресценция на тъкан, дори с една и съща локализация, варира значително от пациент на пациент, при измерване на всеки пациент спектрите на автофлуоресценция на лингвалната повърхност на епиглотиса (при изследване на ларинкса) или малката увула (при изследване на фаринкса) бяха записани като референтна точка.
Критерии за включване в изследването:
- възраст от 18 до 70 години;
- неоплазма на ларинкса и (или) фаринкса (доброкачествена или злокачествена), потвърдена или изискваща хистологично изследване;
- хронично заболяване на ларинкса или фаринкса, изискващо последващо хистологично изследване;
- съгласие за участие в изследване;
- здрави лица (контролна група).
- бременни и кърмещи;
- са били подложени на локален инвазивен метод на лечение или диагностика на изброените заболявания през последните 3 седмици;
- анатомични и физиологични особености, които възпрепятстват изследването;
- използвани тетрациклинови антибиотици през последните 2 седмици (този критерий е свързан с наличието на силна тетрациклинова луминесценция);
- подложени на диагностични мерки с въвеждането на екзогенни флуорофори.
При допълнителни предпазни мерки преди и след диагностично измерване пациентите не го правяттрябва.
По време на ex vivo наблюдения са изследвани биопсии на неоплазми на лигавицата на ларинкса и фаринкса, получени по време на операция (биопсия), както и ларинкс и фрагменти от лигавицата на фаринкса, получени в резултат на ларингектомия и кръгова резекция на фаринкса.
Преди измерванията препаратите се измиват от видими следи от кръв с физиологичен разтвор.
Измерванията се извършват, ако е възможно, при същите условия на докосване на пробата с края на оптичната сонда, както бяха измерванията in vivo. Изследванията се провеждат не по-късно от 5 часа след отстраняването на тъканните срезове. Пробите се съхраняват във физиологичен разтвор.
Обработка на получените резултати
CDC - коефициент на диагностичен контраст, параметър, по чиято числена стойност се взема диагностично решение. CDC се изчислява чрез съотношението на стойността на интензитета на автофлуоресценцията в зоната, подозрителна за наличие на неоплазма, към стойността на интензитета на автофлуоресценцията на непроменената лигавица, т.е.
FTC= I1/I2,
където I1 е интензитетът на автофлуоресценция на неоплазмата, I2 е интензитетът на автофлуоресценция на здравата лигавица на субекта при същата дължина на вълната. За да се определи дължината на вълната, при която стойността на QBO е най-информативна, в хода на изследването изчислението беше извършено върху целия спектър.
Важна особеност на CDC е, че при изчисляването му се сравняват измерените стойности на физическите параметри в туморни тъкани и непроменени тъкани на същия пациент, което позволява да се изключи влиянието на структурните и функционални особености на тъканите на изследваните лица.
Поради факта, че спектрите на флуоресценция могат да зависят както от характеристиките на структурата и състава на изследваната област, така и от условиятасондиране (ъгъл на наклон на сондата, сила на натискане и т.н.), за да получим надеждни данни, извършихме набор от статистически данни. При провеждане на флуоресцентна диагностика са получени голям брой измерени спектри (най-малко 12 от всеки субект). Въз основа на получените данни са изчислени средните стойности на интензитета на флуоресценция на нормалните зони (Ifl.n.) и флуоресценцията на тумора (Ifl.o.) за всеки пациент. Тези стойности бяха използвани за определяне на ABC на здрава и неопластична лигавица при всеки пациент.
За регистриране и архивиране на данните, получени в резултат на изследването на всички групи пациенти, е съставен протокол от изследването, който включва паспортни данни, предварителни и окончателни диагнози, дата на изследването, номера на файлове с резултати от спектроскопия. Получените в резултат на изследването автофлуоресцентни спектри бяха въведени в базата данни.
Целият проучен материал след измервания е изпратен в патологоанатомичния отдел на KB SSMU на име I.I. С.Р. Миротворцев, за хистологично изследване.
Ефективността на автофлуоресцентната спектроскопия се определя чрез сравняване на данните от спектроскопията (изчисляване на QDC, анализ на формата на спектъра и стойностите на интензитета на автофлуоресценцията) с резултатите, получени от хистологично изследване. Статистическата обработка на резултатите от изследването е извършена с помощта на компютърната програма Mathcad 2001 Professional.
Проучването включва 50 пациенти на възраст от 18 до 70 години, контролната група се състои от 10 души без патология от ларинкса и фаринкса (Таблица 1).
Таблица № 1. Учебни групи.
Проучванията са проведени в ex vivo и in vivo условия. Количественото съотношение на видовете изследвания е представено втаблица 2.
Таблица № 2. Количествено съотношение на видовете изследвания.
РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ
Трета глава анализира данните, получени по метода на автофлуоресцентната спектроскопия, както и сравнението им с диагнозите, които са установени въз основа на резултатите от клинични и хистологични изследвания.
При изследването на 31 пациенти със злокачествени новообразувания на ларинкса и фаринкса (I група) са получени характерни спектрограми, показани на фиг.3.
Стойността на интензитета на автофлуоресценцията за всяко изследване беше осреднена за поне три измервания.
Във всички разглеждани случаи на плоскоклетъчен карцином спектрите са записани с голяма разлика между интензитетите на автофлуоресценция на здрава и туморна тъкан и характерни максимуми при 370 nm и 440 nm. Характерна особеност на всички наши измервания е значително намаленият интензитет на автофлуоресценция в огнището на злокачествено заболяване. Интензитетите на спектрите на автофлуоресценция на рак варират от 0,1 до 0,5 относителни единици.
Средният интензитет на автофлуоресценция на плоскоклетъчен карцином при дължина на вълната 440 nm е 0,25±0,09 относителни единици, с коефициент на вариация 36%. Средният интензитет на визуално здравата лигавица е 2,91±0,45 относителни единици, коефициентът на вариация е 15,1%.
Въз основа на получените данни се изчислява диагностичното контрастно съотношение (CDC) - диагностичен критерий, който ни позволява да приемем наличието на злокачествено новообразувание в определена област на лигавицата. Средната стойност на CDC в групата пациенти със злокачествени новообразувания на ларинкса и фаринкса е 14,56±5,59. Коефициентът на вариация е 37,8%. По спектърнаблюдава се лека промяна в CDC, но най-големите нормални/патологични разлики са получени в областта от 400 nm.
Наред с общото намаляване на интензитета на флуоресценция с развитието на злокачествено новообразувание, има изместване на максималната интензивност в спектъра от 408-410 nm за норма до 435-455 nm в случай на неоплазма. Докато се придвижваме към центъра на тумора, това изместване става по-изразено.
Характерът на спектрите с промяна в локализацията на сондирането показва ясна връзка с морфологичната структура и съответства на концепцията за хистологичната структура на злокачествен тумор и здрава лигавица на ларинкса и фаринкса (фиг. 4), (фиг. 5).
Ориз. 4 Хистологичен препарат, съответстващ на спектъра на централната част на некератинизиращ рак на ларинкса.
При изследване на 19 пациенти с доброкачествени новообразувания на ларинкса и фаринкса (група II) е характерна графиката, показана на фиг. 6.