Биотехнологични методи за получаване и култивиране на протопласти

Протопластите на растителните клетки като обект на биологичен дизайн

Методи за получаване и култивиране на протопласти

Изолиране на протопласти

Протопласт - клетка, лишена от целулозна мембрана, заобиколена от цитоплазмена мембрана, която запазва всички свойства, присъщи на растителната клетка. Протопластите са идентифицирани за първи път през 1892 г. от J. Clerker, който използвамеханичнияметод. С този метод клетъчната стена се нарязва на плазмолирани клетки, протопластите се освобождават в средата. В момента методът е модифициран, подобрен, но има редица ограничения:

ниска производителност
могат да се използват само тъкани с екстензивна плазмолиза,
трудоемкост и продължителност.

Друг метод за изолиране на протопласти еензимният, използващ ензими. През 1952 г. Salton използва ензима лизозим, за да разруши клетъчната стена на бактериите за първи път. През 1960 г. Cocking третира върховете на корените на доматите с хидролитичен ензим от културалната течност на плесенните гъбички (Myrothecium verrucaria) и за първи път получава изолирани протопласти на висши растения чрез ензимен метод.

Предимства на ензимния метод спрямо механичния:

в същото време се освобождават голям брой протопласти (до 10 милиона на грам тъкан или клетки),
клетките не са подложени на силен осмотичен стрес,
клетките не са увредени
методът е сравнително бърз.

Три вида ензими се използват за отстраняване на клетъчната стена: целулази, хемицелулази и пектинази. Комбинацията от ензими и тяхното съотношение е специфично за всеки тип клетка.

Изолирането на протопластите се извършва на триетап:

ензимно лечение,
изолиране на протопластите от клетъчните стени,
отделяне на непокътнати протопласти от клетъчни фрагменти.

Стандартна процедура за протопласти (според Такеба) от листни тъканиNicotiana tabacum:

Зрял, оформен лист се отделя от възрастно растение на възраст 60-80 дни, потапя се в 70% етанол и след това се поставя за 15-20 минути в 10% разтвор на калциев хипохлорит и се измива многократно с дестилирана вода. С помощта на пинсети се отстранява долната част на епидермиса, листата, обелени от епидермиса, се нарязват със скалпел на малки парчета от 4 квадратни метра. вижте За по-добро отстраняване на епидермиса, листата трябва да бъдат леко прибрани, можете също да ограничите подаването на вода, преди да отрежете листата.

След това тъканта се третира последователно или едновременно с пектиназа, която причинява мацерация, и целулаза, която разрушава клетъчните стени. Оптималната концентрация на ензими, както и времето за обработка са индивидуални за различните тъкани. Протопластите трябва да се държат в ензимния разтвор за минимално време, последвано от щателно измиване. Ензимите се стерилизират през бактериални филтри.

Регулирането на клетъчния воден обмен е свързано с наличието на клетъчна стена. Когато протопластът е "гол", един от компонентите на регулацията на обмена на вода се губи; следователно, осмотичните свойства на изолиращата и култивационна среда стават важни. Средата трябва да е леко хипертонична, така че протопластите да са в леко плазмолизирано състояние. Тези състояния инхибират метаболизма и регенерацията на клетъчната стена. Като осмотични стабилизатори се използват захари (глюкоза, манитол, сорбитол, ксилоза), йонни осмотични агенти (CaCl2, KCl) в концентрация 0,3 - 0,8 mol/l. Концентрациите се избират индивидуално за всекирастителен обект.

По-удобно е тъканите да се обработват с ензими в петриево блюдо, което се държи под ъгъл от 15 o. Сместа от ензими с протопласти се прехвърля в центрофужни епруветки. Отделянето на протопластите от ензимната смес може да се извърши по два начина: чрез филтруване с центрофугиране или чрез флотация.

По време на филтрирането сместа преминава през филтри с размер на порите 40 μm. В същото време върху филтъра остават бучки от клетки и техните големи фрагменти. При по-нататъшно центрофугиране протопластите се утаяват и фрагментите остават в супернатантата. При многократно центрофугиране ензимът се отмива, след което протопластите се прехвърлят в хранителната среда.

Методът на флотация е предложен от O. Gamborg и др., през 1981 г. и е предназначен за отслабени протопласти. Основава се на факта, че протопластите имат по-ниска плътност от органелите или остатъците от клетъчната стена. Към първоначалната смес се добавя разтвор на захароза и се центрофугира при скорост от 40–80 до 350 g. Чистите протопласти плуват, фрагментите се утаяват на дъното.

Протопластите могат също да бъдат изолирани от суспензия и клетъчни култури. Най-хубавото е, че в късния етап на логаритмичен растеж, когато клетъчните стени се разрушават по-лесно, протопластите са най-жизнеспособни.

След това протопластите се култивират при същите условия като клетките. Съставът на солите може леко да се промени. Средата се състои от осмотичен стабилизатор, неорганични съединения, източник на въглерод, азот, витамини, фитохормони. Условия на култивиране: средно pH 5,4 - 5,8, температура 22 - 28 ° C, слабо осветление (не повече от 2000 лукса).

Методи за култивиране на протопласти

Има два метода за култивиране на протопласти: метод с течна капка и метод на посяване.

В първия случай, окачванетопротопластите под формата на капки се поставят върху пластмасови петриеви панички. Разновидност на този метод е култивирането на единични изолирани протопласти в микрокапки с обем 1 μl, предложено от Ю. Глеба през 1978 г.

Във втория суспензията на протопластите се излива в пластмасови петриеви панички, добавя се равен обем от същата среда с 1% агар при температура не по-висока от 45 ° C. След охлаждане петриевите панички се обръщат и култивират при 28 ° C. В този случай протопластите се фиксират в едно положение и физически отделени един от друг. Това дава възможност да се наблюдава развитието на непокътнатия протопласт: образуването на клетъчната стена, деленето, растежа и развитието на растението. Вариант на тази техника е използването на кърмещи протопласти или клетки, изложени на рентгенови лъчи или γ-лъчение, което блокира способността им да се делят. Такива протопласти или клетки се смесват с жизнеспособни протопласти и те поддържат и стимулират техния растеж.

Веднага след отстраняването на ензимния разтвор започва образуването на клетъчната стена. По-трудно е да се постигне клетъчно делене и регенерация на растенията. Регенерацията на растенията става или чрез ембриогенеза, или чрез развитие на калус с по-нататъшно индуциране на морфогенеза. Това се постига чрез добавяне на ауксини към средата или чрез комбиниране на ауксини с цитокинини.

Пролиферацията на клетки, получени от протопласти, се влияе от 4 фактора:

видова специфика и физиологично състояние на оригиналната растителна тъкан,
метод и условия за изолиране на протопласти,
плътност на засяване на протопласти,
съставът на хранителната среда.