Допълнителни материали за лабораторна диагностика на ентеровирусна инфекция
Човешките чревни вируси (ентеровируси) са членове на рода Enterovirus от семейство Picornaviridae. Те включват вируси на полиомиелит (3 серотипа), Coxsackie A (24 серотипа), Coxsackie B (6 серотипа), ECHO (34 серотипа) и човешки ентеровируси 69-72 серотипа. Ентеровирус 70 причинява остър хеморагичен конюнктивит, ентеровирус 72 причинява вирус на хепатит А. Родът Enterovirus включва също чревни вируси на животни (говеда, маймуни, прасета, мишки) и насекоми. Ентеровирусите на животните се характеризират с видова специфичност.
Моля, обърнете внимание: Coxsackie A 23 е идентичен на ECHO 9. ECHO 28 е класифициран като риновирус, ECHO 34 е вариант на Coxsackie A 24
Ентеровирусите причиняват увреждане на централната нервна система (енцефалит, менингоенцефалит, полиомиелит, менингит), стомаха и червата (диария, хепатит, панкреатит), дихателните пътища (ринит, фарингит, неонатална пневмония и др.), сърдечно-съдовата система (миокардит, перикардит). Възможно е също така развитието на херпесна ангина, екзантема, везикулозен стоматит, миалгия и конюнктивит. Различните ентеровируси могат да причинят едни и същи клинични прояви, докато един ентеровирус може да доведе до развитие на различни клинични синдроми.
Материалът за изследването е изпражнения, тампони от носната част на фаринкса, цереброспинална течност, кръв, серум, съдържание на везикули, урина, асцитна течност. От трупа се вземат за изследване кръв, гръбначно-мозъчна течност, тъкан на гръбначния и продълговатия мозък, варолиев мост, части от червата и тяхното съдържание, части от черен дроб, далак, бял дроб, панкреас, миокард и лимфни възли. Материалът се взема в първите часове на заболяването, от трупа - не по-късно от 3-4 часа след смъртта.
Кръв (около 10 мл) завирусологичен анализ и приготвяне на серум, взет на празен стомах в началото на заболяването и след това след 3-4 седмици.
Изпражненията (4-6 g) се събират на интервали от 1-2 дни (може да се използват флакони с антибиотик). Приготвя се 10% суспензия в разтвор на Hank, разклаща се и се избистря чрез центрофугиране за 30 минути при 3000 rpm (ако е възможно, материалът се центрофугира при 10 000 rpm). Супернатантата се третира с етер (към избистрената фекална суспензия се добавя 50% обем диетилов етер, сместа се оставя в хладилник под памучно-марлева запушалка за 12-16 часа) и антибиотици.
Ректалните тампони се поставят в епруветка с 1-2 ml разтвор на Hanks или Earl, изплакват се, изстискват се. Материалът се центрофугира и се третира с етер и антибиотици.
Фарингеално промиване в обем от 20 ml се получава чрез 2-кратно (с интервал от 3 минути) гаргара със стерилен физиологичен разтвор или дестилирана вода. Тампоните избърсват задната стена на фаринкса, сливиците и палатинните арки и се потапят в епруветка с 1-2 ml разтвор на Ханк. Материалът се центрофугира и се третира с етер и антибиотици.
За изолиране на вируса без предварителна обработка се използва стерилна бистра цереброспинална течност (около 3 ml). Мътната цереброспинална течност, както и съдържащата еритроцити, се центрофугира. Урината в обем от 10 ml се взема в стерилен съд в средата на акта на уриниране и се третира с антибиотици.
Проби от срезовия материал се смилат в стерилен хаван, приготвя се 20% суспензия в разтвор на Hank, центрофугира се 5-10 минути при 2000 rpm.
Материалът се третира с антибиотици - пеницилин (1000 IU / ml) и стрептомицин (500 IU / ml) за 2 часа при стайна температура, след което се използва за изолиране на вируса. Част от материала е замръзнали се съхранява при -70°C. Многократното замразяване и размразяване е неприемливо, тъй като води до инактивиране на вируса.
Експресната диагностика не е намерила широко приложение при ентеровирусни инфекции поради особеностите на тяхната патогенеза. Описано е използването наRIFза изследване на клетки на цереброспиналната течност. При ротавирусни инфекции се използватEMиIEM(виж стр. 243).
Изолирането на вирус се извършва в клетъчни култури и върху еднодневни бели мишки (Таблица).
Таблица. Методи за изолиране и идентифициране на ентеровируси
Полиовирусите (1-3-ти), повечето вируси Coxsackie B, ECHO, някои видове вируси Coxsackie A (7-ми, 9-ти, 14-ти, 16-ти, 21-ви), когато се размножават в култура от клетки от бъбрек на маймуна, имат CPD. В културата на човешки ембрионални бъбречни клетки, човешки амнион, диплоидни WI-38 клетки, Coxsackie A (11, 13, 15, 18, 20, 21, 24), ECHO (21, 34) вируси се възпроизвеждат. Повечето Coxsackie A серотипове се размножават и причиняват CPP в клетъчна култура на RD (култура от човешки рабдомиосарком). За да се изолират Coxsackieviruss, новородените мишки се заразяват успоредно с клетъчните култури.
Coxsackie A вирусите могат да бъдат най-успешно изолирани от материал от пациенти само върху еднодневни кърмачки, тъй като те не се размножават в повечето клетъчни култури на маймуни и хора.
Бозаещите мишки се заразяват в мозъка (0,01 ml), подкожно (0,03 ml), интраперитонеално (0,05 ml) или комбинация от методи. Инокулираните животни се наблюдават в продължение на 14 дни. С развитието на клиничните симптоми се приготвя 20% суспензия от мозъка на болни животни и трупове за по-нататъшно преминаване на вируса. Вземете и парчета тъкан за хистологично изследване.
Ентеровирусите се показват чрез CPP и образуване на плака.под агарови или бентонитни покрития, в клетъчна култура, развитието на парализа при кърмачки и тяхната смърт, както и физикохимични свойства: малък размер, устойчивост на мастни разтворители и ниски стойности на pH (3,0), термична стабилност при температура 50 ° C в присъствието на 1 М MgCl2 (магнезиев хлорид).
За идентифициране на ентеровируси се използват RN, RTGA, RSK, RPG, RIF с типово специфични имунни серуми.
РНсе провежда в клетъчна култура или върху кърмачки по общоприетия метод.
Идентифицирането на щамове на Coxsackie A. B и ECHO вируси с хемаглутиниращи свойства се извършва с помощта наRTGAкато се използват антигени от заразени клетъчни култури и 1% суспензия от човешки еритроцити от група 0 (I).
ЗаRCC, вместо антисеруми, се използва миша имунна асцитна течност, която има по-малко антикомплементарност.
RPGдава добри резултати с антиген, концентриран 200-400 пъти.
Бентонитният метод се използва за концентриране на ентеровируси. 0,05-0,1% бентонит гел от сухото тегло на сорбента се добавя към 500 ml от култивираната течност, съдържаща виболгар, рН на сместа се регулира до 3,5-4,0 с 0,1 N разтвор на НС1. Сместа се разклаща за 3-5 минути, центрофугира се при 2000-3000 rpm за 10-15 минути. Утайката (вирус-бентонит) се промива с 20-40 ml дестилирана вода. Вирусът се елуира с 0,05 М Tris буферен разтвор (рН 9,0) при енергично разклащане в продължение на 4-5 минути. След това сместа се центрофугира и се изследва супернатантата, съдържаща вируса. Този метод ви позволява да концентрирате вируса 100-200 пъти.
За серологична диагностика се използват RN, RSK, RTGA. Диагностична стойност има 4-кратно или повече увеличение на титъра на антителата.Резултатите от серологично изследване трябва да се сравнят с вирусологични, епидемиологични и клинични данни.
За провеждане наРН100 дози от вируса се смесват с 2-кратно разредени серуми на пациента. При провеждане наРНв клетъчни култури, резултатите се вземат предвид на 3-4-ия и 7-8-ия ден, на кърмачки - на 10-14-ия ден.
RSKсе използва за диагностициране на полиомиелит. Диагностичното значение е откриването на антитела в титър 1:32 и повече, както и повишаване на титъра на антителата 4 пъти или повече. Най-добри резултати се получават от ненагрети (ниско реактивни) антигени, получени чрез еднократно замразяване и размразяване на заразени клетки след началото на пълно специфично унищожаване.
RTGAрядко се използва за серологична диагностика на ентеровирусни инфекции. Получава се хемаглутиниращ антиген с висок титър на вируса (10 6 - 10 7 TsPD50 / ML). Серумите на пациентите се обработват за отстраняване на спонтанни хемаглутинини и неспецифични инхибитори на хемаглутинацията.