ЕКСПРЕСИЯ НА ГЕНИ ЗА КЛУСТЕРНА ЗАЩИТА В ОТГОВОР НА ВИРУСНА ИНФЕКЦИЯ В ДВА ЕКОТИПА НА ARABIDOPSIS
В еукариотния геном гените не са произволно разпределени и една от причините за това разпределение е, че нехомоложните гени, участващи в едни и същи биохимични или физиологични процеси или активирани на определени етапи на развитие, са предимно локализирани близо един до друг, образувайки клъстери. Тъй като клъстерните гени съставляват значителна част от еукариотния геном, тяхната структурна и функционална организация е от значителен интерес. Въпреки че такива клъстери от функционално свързани гени са открити в много моделни геноми, включително генома на Arabidopsis [8], малко се знае за механизмите на съвместно активиране и потискане на членовете на клъстера. По-специално, практически няма информация за възможността за образуване на клъстери от гени, които реагират на действието на абиотични и биотични фактори на околната среда, както и тяхната съвместна регулация. В настоящата работа ние идентифицирахме и проучихме експресията на гени, съставляващи два независими клъстера в чувствителни и устойчиви екотипове на Arabidopsis при нормални условия и в растения, заразени с CMV (Y) краставичен мозаечен вирус.
Материали и методи на изследване
Култивиране на Arabidopsis, пречистване на вируса и заразяване на растенията.
Растения Arabidopsis от екотип Columbia-0 и екотип C24 се отглеждат в продължение на 21 дни в климатична камера с 16-часов фотопериод при 24°C. Жълтият щам на вируса на краставичната мозайка (CMV(Y)) е любезно предоставен от H. Takahashi [7]. Размножаването на вируса се извършва върху тютюневи растения Nicotiana benthamiana и се пречиства чрез диференциално центрофугиране, както е описано по-горе [5]. Вирусите се ресуспендират до концентрация от 0,5 mg/ml в 20 mM калиев фосфатен буфер (рН 7,2) и 10 ul от суспензията се използват за заразяване на листата.триседмични растения чрез натриване с частици карборунд. С контролните растения същата процедура се провежда с фосфатен буфер. Като проба бяха взети 2–3 листа от 3–5 растения 1, 3 и 5 дни след инокулацията, замразени в течен азот и съхранени при –80°C, докато се изолира РНК.
Изолиране на РНК, синтез на cDNA на първата верига и количествена PCR в реално време.
Изолирането на обща РНК се извършва с помощта на Trizol-Reagent съгласно инструкциите на производителя (Invitrogen). Първата верига cDNA се синтезира с помощта на комплекта SuperScript First-Strand cDNA Synthesis System съгласно инструкциите на производителя (Invitrogen). PCR в реално време се извършва с помощта на комплекта iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) на MiniOpticon Real-Time PCR система (Bio-Rad). PCR условия в реално време: 94 °C - 1 мин. (1 цикъл); 94°C - 30s, 60°C - 30s, 72°C - 30s (30 цикъла). Амплификацията се извършва в два екземпляра. Гените на Arabidopsis ACTIN1 (AT2G37620) и UBQ5 (AT3G62250) бяха използвани като вътрешна контрола в PCR реакции в реално време.
Списък на клъстерните гени, изследвани в експеримента.
AT5G49480, AT5G49490, AT5G49510, AT5G49520, AT5G49525, AT5G49530, AT3G04700, AT3G04710, AT3G04715, AT3G04717, AT3G04730, AT3G04735, AT 3G04740, AT3G04750, AT3G04720.
Генератор на произволни числа беше използван за получаване на произволно разпределение на размера на клъстерите. Бяха получени 4935 случайни уникални числа (според резултатите от предишна работа, вие сте броят на активираните защитни гени в глобалния профил на експресия [3]) в диапазона 1-27379 (общият брой на гените на Arabidopsis според последната версия на генома). Ако приемем, че поредица от числа от 1 до 27379 е редът на гените в геномаArabidopsis, всяко число по този начин присвоява произволна позиция в генома на един от 4935 отговорни гена. От 100 итерации бяха получени средни стойности за произволно разпределение на размера на клъстерите.
Резултати от изследването и дискусия
Преди това, използвайки метода за хетероложно картографиране EST (Expressed Sequence Tags) като алтернатива на технологията с микрочипове, ние изградихме профил за целия геном на реакцията на Arabidopsis към биотичния стрес и идентифицирахме 4935 гена, свързани с отговора на растенията към инфекция [3].
В настоящата работа, чрез компютъризирано профилиране, открихме 1594 клъстерни гени (32%), разпределени във всички хромозоми, които могат да бъдат свързани със защитен отговор. Клъстерът се определя като група от съседни гени с положителна стойност на профила [2]. За да се определи дали наблюдаваното разпределение на генни клъстери в техния размер (броя на гените в клъстер) се различава от случайното, ние създадохме стохастичен модел на разпределение, използвайки генератор на произволни числа, както е описано по-рано [2]. На фиг. 1 е представен сравнителен анализ на наблюдаваните и стохастични разпределения. Според теста chi2 образуването на генни клъстери, свързани с патогенезата, не е случайно (p = 1.2316E-242, т.е. p