Етапи на получаване на рекомбинантни (хибридни) ДНК молекули

Етапи на получаване на рекомбинантни (хибридни) ДНК молекули - раздел Образование, Същност на живота 1. Получаване на изходен генетичен материал - генно кодиране Междун.

1.Получаване на оригиналния генетичен материал - гена, кодиращ протеина (характера) от интерес

Необходимият ген може да бъде получен по два начина: изкуствен синтез или изолиране на естествени гени
Изкуственият синтез на гени извън тялото е възможен по два начина:

qЕнзимен синтез- "изрязване" на необходимия ген от донорната ДНК на клетките на интересуващия ни организъм с помощта на специални ензими -рестиказа

vРестрикционни ензими- ензими, принадлежащи към класа на хидролитичните ензими (хидролази), а именно групатануклеазиилиендонуклеази- ензими, които хидролизират връзките на нуклеинови киселини (ДНК и РНК) вътре в полимерната верига съгласно строго определени нуклеотидни последователности; Понастоящем са известни около 500 рестриктази, които са специфични за определени триплети.

v Всеки рестрикционен ензим разрязва ДНК молекулата само на мястото, където се намира определен триплет, който може да разпознае от много други; в резултат двойната верига на ДНК се разделя на секции (гени)

v Когато ДНК се раздели, се формират нейни фрагменти (гени), които имат едноверижни, така наречените „лепкави краища“, които имат комплементарни бази, които в присъствието на друг ензим могат да се свържат (залепят заедно) с комплементарни „лепкави“ краища на друга ДНК, предварително отрязани с рестриктази

v Рестрикционният ензим разпознава своя триплет в ДНК молекула от всякакъв произход - било то едноклетъчни организми, растения, животни или хора, следователно, лепкавите краища, образувани в ДНК молекули (гени) от различнипроизход ще завършват в едни и същи триплети и могат да се комбинират допълващо

а) изкуствен генен синтез in vitro от отделни нуклеотиди (първо синтезиран от индиеца Г. Корана през 1970 г.)

v От клетките се изолира и-РНК, която е транскрипционно копие на желания ген и с помощта на ензима - обратна транскриптаза се синтезира комплементарна на нея ДНК верига; след това i-РНК, сдвоена с ДНК веригата, се разрушава от специален ензим, а останалата ДНК верига служи като шаблон за синтеза на комплементарна втора ДНК верига; получената ДНК двойна спирала се нарича c-DNA (комплементарна ДНК) и е желаният ген (c-DNA няма интрони като всички бактериални гени)

v Човешки, заешки, гълъбови глобинови гени, гени за синтез на човешки инсулин и соматостатин, гени за митохондрии на черен дроб на плъхове и др. са синтезирани изкуствено.

2.Изолиране на ДНК - вектор и неговото ограничаване (изрязване)

Векторе ДНК фрагмент, който прехвърля ген в клетка гостоприемник
Като вектор се използва плазмид или вирус.

vПлазмиди– малки кръгли двойноверижни екстрахромозомни ДНК молекули в прокариотни (бактериални) клетки; като правило те носят гени, които контролират черти, които не са свързани с жизнени функции и са способни да се репликират независимо; когато създавате определени условия в една клетка, можете да получите хиляди копия на плазмиди; плазмидите могат да навлизат в други клетки чрез пресичане на техните мембрани

Плазмидът (векторна кръгова ДНК) се нарязва (ограничава) в една точка, превръщайки го от кръгова структура в линейна

Рестрикция- рязане на ДНК с рестриктазна ендонуклеаза на фрагменти с "лепкава"завършва

И за двете ДНК молекули, т.е. същите лепкави краища са получени за плазмида и изолирания ген поради използването на същия тип рестрикционни ензими

3.Затваряне на изолирания ген с ДНК на вектора с цел получаване на хибридни ДНК молекули - лигиране

Лигиране– свързване на ДНК фрагмент (ген) с плазмидна ДНК чрез ензим лигаза за образуване на кръгова рекомбинантна ДНК (плазмиден вектор)

Повторното обединяване на плазмида и с изолирания ген става в отделна епруветка поради комплементарните азотни бази, присъстващи в техните лепкави краища.
Изолираният ген се вмъква ("зашива") в разреза на плазмида и лепкавите краища затварят линейната молекула в пръстен; в резултат на това се образувавектор, който вече представляварекомбинантна ДНК молекула(ДНК молекула, съдържаща чужд ген, се нарича още химерна молекула)
За затваряне на изолирания ген от ДНК вектора се използват ензими -лигази (ДНК - лигаза, които помагат на лепкавите краища да се свържат

vЛигази -клас ензими, които катализират реакциите на свързване на две различни ДНК молекули една към друга, както и възстановяване на нормалната им структура след частично увреждане

3.Трансформацияилитрансгенеза - въвеждане на рекомбинантни плазмидни вектори в третирани бактериални клетки

Плазмиден вектор (рекомбинантна ДНК) се използва катоносителна вграден в него ген в клетка на друг организъм (клетъчна реципиент на бактерии или животни), където на негова основа ще се извърши протеинов синтез с помощта на технологията на микробиологичния синтез (като молекула на ДНК, плазмидният вектор може успешно да работи в клетка реципиент, когато в него са вградени чужди гени,иззети от клетки на растения, животни и дори хора; такива клетки и организми се наричат трансгенниилихимерни)

v Най-често използваната реципиентна клетка са E клетки на Escherichia coli. коли или дрожди; започва молекулярноклониране- получаване на колония от бактериални клетки, съдържаща рекомбинантна ДНК молекула и синтезираща даден протеин (всички потомци на трансформирана бактерия се наричат клонинг); повече от милион копия на всеки желан ген на човек или друг висш организъм могат да бъдат получени чрез клониране

v За да се увеличи проникването на рекомбинантни ДНК молекули в клетките, те се подлагат на краткотрайно излагане на силен електрически ток, който създава кухини в мембраните и ги прави пропускливи за кратко време

v Трансформираните бактерии се засяват заедно върху хранителна среда (агар - агар), върху която се размножават, образувайки клонални колонии

Скрининг– селекция сред колонии - клонове на трансформирани бактерии, съдържащи рекомбинантна ДНК

v Ето как се създават нови високопродуктивни щамове бактерии или соматични клетки, които синтезират протеини с търговска стойност, които се прехвърлят в микробиологичната индустрия

v Днес се натрупват клонирани ДНК гени на човешки тъкани и редица селскостопански животни и растения (включително ракови клетки); колекция от различни клонове се наричабиблиотека на клонове, геномна библиотекаилигенна банка; за пълна библиотека на човешкия геном е необходимо да се получат около 800 хиляди различни клонинги; процесът на изолиране и клониране на гени е до голяма степен автоматизиран

Трансферът на гени позволява да се преодолее междувидовата изолация ипрехвърляне на индивидуални наследствени характеристики на един организъм в друг