GLC, HPLC - страница 8

2.1.4. Качествени и количествени анализи

Идентифицирането на вещества чрез HPLC се извършва чрез хроматограма, като се вземат предвид параметрите на задържане на компонентите (обсъдени по-рано в раздела „Газо-течна хроматография“) или по компоненти.

Например, идентифицирането на парацетамол в ректални супозитории може да се извърши, както следва:

A. Когато движението на елуата бъде спряно, анализираната проба се отстранява и се сравнява със спектъра на стандартната проба. Съвпадението на абсорбционните ленти на спектрите показва идентичността на анализираните вещества (фиг. 27).

B. При преминаване на анализирания и стандартния разтвор през кюветите се получават техните хроматограми. Ако времената на задържане съвпадат, се прави заключение за идентичността на веществата, включени в анализираните разтвори (фиг. 28).

C. Идентифицирането на веществата се извършва с помощта на многовълнова (многоканална) хроматография чрез коефициент, изчислен от стойностите на абсорбцията, измерени при различни дължини на вълната (ако детекторът позволява).

Фигура 29 показва многовълнова хроматограма на анализирания разтвор на еналаприл малеат (0,01 g таблетки).

Фигура 30 показва хроматограма, получена от анализа на цитрамон, който съдържа парацетамол, кофеин, ацетилсалицилова киселина. Хроматограмата показва пиковете на всички посочени съставки и техните времена на задържане, съответстващи на стандартни проби.

∙ чрез сравняване на пиковите площи на анализираните и стандартните вещества, получени при едни и същи условия;

∙ метод на вътрешен стандарт;

∙ използване на калибровъчна крива.

Оптична абсорбция, O.E.

Фиг.27. анализирани (а) истандартни (б) разтвори (ректални супозитории с парацетамол 0,5 g)

Ориз. 28. Хроматограми на анализирани (А) и стандартни (Б) разтвори (ректални супозитории с парацетамол 0,5 g) с UV детекция

Фиг.29. Хроматограма на анализирания разтвор на еналаприл малеат (таблетки 0,01 g) с UV детекция

∙ метод на вътрешен стандарт;

∙ използване на калибровъчна крива.

2.1.5. Съвременни течни хроматографи

Ориз. 31. Външен вид и схема на хроматографа „Милихром

Съвременните течни хроматографи са оборудвани с микропроцесор и устройства, които могат да се използват за автоматично въвеждане на проби, поддържане на условията на хроматографския процес според дадена програма, автоматично оптимизиране на условията за разделяне, идентифициране и изчисляване на количествения състав на анализираната смес с помощта на една или няколко програми.

Понастоящем за HPLC анализ се използват хроматографи от серията Milichrom, Hewlett Packard и др.

По-долу са външният вид и схемата на хроматографа Milichrom (фиг. 31), външният вид на хроматографа Milichrom 5 (фиг. 32),

.външен вид и характеристики на хроматограф HP 1100 (фиг. 33).

Високоефективен микроколонен течен хроматограф "Milichrome" е предназначен за работа в стационарни, мобилни или полеви лаборатории, които извършват анализи на качествения състав и количественото съдържание на вещества за различни индустрии, медицина, криминалистика, селско стопанство, опазване на природата, наука.

Ориз. 32. Външен вид на хроматографа

Оборудване ипринцип на работа на течния хроматограф HP1100 (фиг. 33).

1. Тава за разтворители. Разтворите от него се подават през дегазатор към колоната. Осигурени са четири работни колби, оборудвани със стъклени филтри на Шот.

2. където разтворите са освободени от разтворени газове, така че в колоната да не се образуват мехурчета и застояли зони, които нарушават формата на пиковете, а оттам и резултатите от анализа (невъзможност за адекватно изчисляване на площта под кривата).

3. Устройството включва две помпи: градиентна и изократична. Градиентната помпа доставя две или повече течности в зависимост от зададените точки (има четири канала). Изократична помпа ги смесва и ги подава по-нататък в колоната.

4. Инжекторът за проби може да бъде ръчен (спринцовка), автоматичен или автосамплер. При наличието на последния има специални флакони с вместимост 2 ml за изследваните разтвори, които се поставят в таблата: мястото на всеки флакон е номерирано от 1 до 100.

Специално устройство (държач или захват) изважда желания флакон от гнездото, прехвърля го в отделението за инжектиране на пробата, иглата се повдига, флаконът се поставя на място, иглата се спуска във флакона и се взема определеното количество разтвор. Държач за въздух

завърта флакона на място и пробата се инжектира в хроматографската колона.

Ориз. 33. Външен вид на течния хроматограф HP 1100, произведен от

5. Температурата в това устройство може да се задава и поддържа от 15 до 70 0 С.

6. Инжектираната проба преминава през колоната; компонентите, ако има няколко, се разделят и излизат от него, след което регистрират де-

7. Това устройство е снабдено със спектрофотометър, който има проточна клетка и регистрира веществата, преминаващи през нея.

8. Устройството се управлява от компютър, съдържащ специална програма "Chem Station".

Работният прозорец на Chem Station съдържа мнемонична диаграма на цялото устройство: символично изображение на флакони с проби, инжектор, помпа, колона в термостат, детектор, компютърна система и принтер.

Условията за хроматографско разделяне, разработени за тестовата смес, се въвеждат в специални диалогови прозорци, предоставени от програмата Chem Station. В същото време се формира метод (Method) и се въвежда в списъка с методи. В бъдеще при достъп до този метод компютърът автоматично задава всички зададени параметри.

Следва попълване на информация за образеца (Sample info), т.е. име, сериен номер, размер на извадката и др., който се съхранява в паметта

компютър и минимизира (или елиминира) традиционния лабораторен дневник.

Получените хроматограми се подлагат на аналитична обработка по различни начини. Това могат да бъдат изчисления с помощта на калибровъчни графики или хроматограми на стандартни проби, които определят концентрацията на изследваните проби.

Уредът представя резултата от анализа под формата на така наречените отчети (Report), които при желание могат да съдържат или кратка информация (Short Report) - хроматограма и данни за получените пикове: пикови площи, време на задържане и др., или подробна информация (Performance Report), включително критериите за разделяне на съседни пикове, броя на теоретичните плаки и др.

2.1.6. Алтернатива на традиционния HPLC

Високоефективната течна хроматография, като най-важният метод за фармакопейен анализ на вещества и лекарствени продукти, в същото време остава един от най-трудоемките, отнемащи време искъпо. Така например анализът на ампицилин по метода, описан в Европейската фармакопея, отнема повече от 15 часа. Високата чувствителност на HPLC (както и GLC) към всякакви промени в параметрите на разделяне - експериментални условия, материали и оборудване - затруднява възпроизвеждането на описаните методи. Досега е в сила следният принцип за разработване на аналитичните методи: „всяко вещество има свой собствен метод за анализ“, при който се установява своя „уникална“ процедура за анализ, изискваща използването на „своя“ хроматографска колона, „свои“ подвижни фази, „свой“ метод за калибриране на хроматограф.

Като алтернатива на традиционната HPLC, редица чуждестранни токсиколози (S. Baker, M. Bogusz, S. Elliot и др.) и виден български специалист по течна хроматография G.I. Барам предложи да се използва принципът за създаване на унифицирани методи за анализ на редица съединения в една и съща хроматографска система (колона с обратна фаза, градиентно елуиране. Пиковете се идентифицират на хроматограмата на тестовата проба чрез сравняване на техните времена на задържане и спектрални характеристики в региона с параметрите, получени преди това за стандартни вещества. Наборът от тези параметри е „база данни“, а хроматографът, който позволява анализ с помощта на базата данни, се нарича