Характеристики на култивиране на животински клетки, UMTS
Приложение на анализаторите Bioprofile FLEX в животински клетъчни култури.
Ферментация. Обща информация.
Под ферментация се разбира целият набор от последователни операции от въвеждането на инокулум в предварително приготвена и загрята до необходимата температура среда до завършване на процеса на клетъчен растеж или биосинтеза на целевия продукт. В края на ферментацията се образува сложна смес, състояща се от продуцентски клетки, разтвор на неконсумирани хранителни компоненти и продукти на биосинтеза, натрупани в средата. Тази смес се нарича културална течност.
В зависимост от целта на производството - получаване на клетки или техните метаболитни продукти - методите за провеждане на основната ферментация се различават. Ако процесът е насочен към получаване на биомаса, тогава целта на ферментацията е да се получи максимален възможен титър на клетките, а в случай на получаване на метаболити, тяхното натрупване се извършва едновременно, а максимумите на образуването на производителя и целевия продукт винаги се изместват във времето. Следователно продължителността на ферментацията в първия случай винаги е по-малка, отколкото във втория.
Ако целта е да се получи биомаса от промишлен щам в партиден процес, тогава времето за култивиране не надвишава 24 часа.При производството на първични метаболити времето за биосинтеза е 48-72 часа, а вторичните метаболити - 72-144 часа среда / мин.
Има няколко начина за извършване на ферментация - периодична, полупериодична, непрекъсната и многоциклична.
Партидният процес е процес, при който ферментаторът се захранваинокулум, задават се определени технологични параметри (температура, pH, скорост на бъркалка) и процесът протича самостоятелно с образуването на целевия продукт. Този процес не е икономически изгоден, т.к. образува се малко целеви продукт.
Полу-сериодният процес се различава от периодичния по това, че различни хранителни вещества (източници на въглехидрати, азот) се добавят към ферментатора по време на ферментационния процес, рН се регулира по време на ферментационния процес и се добавя прекурсор в определен момент от ферментацията. Полусерийният процес е икономически изгоден с висок добив.
Същността на непрекъснатия процес е, че определено количество културална течност се взема от ферментатора в процеса на биосинтеза и се въвежда в друг ферментатор, в който също започва биосинтезата. Културалната течност действа като инокулум. Същото количество вода се добавя към ферментатора, от който е взета част от културалната течност, и процесът на биосинтеза продължава в него. Тази операция се повтаря постоянно. Използвайки необходимия брой ферментатори и постоянно прехвърляйки част от културалната течност от един ферментатор в друг, се постига затворен цикъл. Предимството на непрекъснатия процес е, че етапът на отглеждане на семената е съкратен.
В края на ферментацията на многоцикловия процес 90% от културалната течност се източва от ферментатора, а останалата част действа като семе.
Характеристики на животинската клетъчна култура.
Животинските клетки се различават по много начини от прокариотните и гъбичните клетки: те растат по-бавно, по-чувствителни са към нараняване и въздушни мехурчета. Тези свойства на клетките влияят върху дизайна на биореактори и ферментатори, вхарактеристики на системата за смесване и аериране, които по време на работа не трябва да създават стресови условия за културата.
Смесването трябва да бъде хомогенно, за да се избегнат температурни и pH градиенти, повишени концентрации на субстрата и продукта. В този случай е необходимо да се вземе предвид чувствителността на клетките към увреждане. Обикновено смесването се извършва с големи лопаткови миксери при ниски скорости. Пневматичното (въздушно) разбъркване в еърлифт реакторите или хидравличното разбъркване с външни помпи в реакторите за суспендирани твърди вещества също решават проблемите, свързани с култивирането.
За да се предотврати образуването на пяна и увреждането на клетките от въздушни мехурчета, обемът на подаваната газова смес може да се намали, може да се използва повърхностно продухване или аерация без мехурчета през мембрани. С намаляване на обема на подавания газ е необходимо да се увеличи концентрацията на кислород в него. Оптималното снабдяване с кислород, азот, въздух и въглероден диоксид се създава чрез системи за смесване на газ.
Култивирането на животински клетки може да се извърши в стационарна (партида), стационарна периодично захранвана или непрекъсната (непрекъсната) култура със или без задържане на биомаса. При стационарна култура клетките растат без добавяне на субстрат след посяване на културата. Въпреки това, липсата на субстрат или образуването на токсични метаболитни продукти може да намали производителността. За да се избегнат тези проблеми, се използва периодична култура с подхранване, при която субстратът или други необходими вещества се добавят на части или непрекъснато. По време на продължително култивиране метаболитните продукти, които инхибират растежа - лактат, амоний, се отстраняват чрез добавяне на компенсиращ обем свежа среда, за да се избегне липсата на субстрат за растеж.
от-поради ниската производителност, свързана с бавния растеж, за животинските клетки се предпочита непрекъснат процес на култивиране със задържане на клетки (перфузионна система). Това води до по-голяма плътност на клетъчната култура и повече контакт на медиите с клетките, което увеличава производителността. Различни системи за филтриране, като ротационни или въртящи се филтри, се използват за задържане на биомаса и предотвратяване на отнасянето й с отстранените обеми културална течност.
Много клетки на бозайници растат само когато са прикрепени към повърхност. Такива мускулно-скелетни клетки са имобилизирани върху микроносители като стъкло, целулоза, колаген, желатин или пластмаса. Ако носителят е порест, клетките могат да растат в него, като същевременно са защитени от стрес на раната, което позволява по-високи скорости на разбъркване и продухване по време на култивиране.
Използване на анализатори Bioprofile FLEX в култура на животински клетки.
Навременното подаване на субстрата към ферментатора и отстраняването на метаболитните продукти осигуряват стабилен растеж на културата и повишават ефективността на процеса на култивиране. Хардуерният комплекс на съвременните ферментери позволява да се контролират такива параметри на култивиране като концентрация на кислород, рН, температура, но контролът на директните показатели за концентрацията на субстрата (например глюкоза) или метаболит (например лактат) се извършва чрез допълнителни методи и устройства. Многопараметричните биохимични анализатори (Bioprofile FLEX ), чийто принцип на измерване се основава на биосензорна технология, стават все по-разпространени за решаване на този проблем. Такива устройства ви позволяват да измервате няколко параметъра наведнъж от една проба. Времето за един анализ е 1-2 минути. Анализаторът може да бъде интегриранв контролера на ферментатора, подаването на хранителна среда може да се извърши според показанията на анализатора. По този начин съвременните биотехнологични анализатори (NOVA Bioprofile FLEX ) позволяват решаването на проблемите с оптимизирането на подаването на храна към ферментатора и отстраняването на метаболитите от ферментационната среда и в крайна сметка постигане на увеличаване на добива на целевия продукт.
Описание на биотехнологичния анализатор Bioptofilr FLEX.
Фиг.1 Пример за резултати от измерване на биохимичния модулБиопрофил FLEX.
АнализаторътBioProfile FLEX съчетава функционалността на три офлайн анализатора (биохимичен анализатор, анализатор за клетъчен брой, осмометър) в едно устройство. Анализаторът има модулен дизайн, включващ модули за газ/електролит, хранително вещество/метаболит, клетъчна плътност/жизнеспособност и осмометрични модули. Модулът за газ/електролит и модулът за хранителни вещества/метаболит използват йонселективни електроди, потенциометрия, амперометрия и ферментация, в зависимост от биосензорите.
Фиг.2 Пример за резултатите от измерването на осмометричния модулBioprofile FLEX.
Модулът за клетъчна плътност/жизнеспособност е разработен отNova Biomedical за преброяване на клетките и оценка на жизнеспособността въз основа на традиционния метод за изключване на триптофан синьо. Първо, проба от клетки се смесва с триптофаново синьо и сместа се инкубира, така че мъртвите клетки да абсорбират триптофановото синьо. След това пробата се утаява върху полупрозрачното дъно на проточната клетка. Поточната клетка се премества във фиксиран микроскопски обектив чрез прецизна система за контрол на движението с висока резолюция на изображението. Определен брой клетки и жизнеспособностчрез обработка на изображения въз основа на дефинирани от потребителя ограничения като живи/мъртви клетки, яркост и средни размери на клетките.
Фиг.3 Модул на жизнеспособността на пробата/клетъчна плътностБиопрофил FLEX.
Всеки модул може да бъде избран индивидуално, всичкиBioProfile FLEX модули изискват само 1 ml проба от културална течност и 7,5 минути за извършване на анализите. Резултатите и потребителските данни се експортират по електронен път във формат на електронна таблица.
Въпреки че интегрираният анализатор с въвеждане на данни елиминира донякъде ръчния труд, само новата уникална автоматична система за вземане на проби, разработена специално заBioProfile Flex(NOVA Biomedical), напълно елиминира ръчния труд.
Многобройни изследвания доказват успешното приложение на новия интегриран многофункционален анализатор и автоматична система за вземане на проби за мониторинг на клетъчни култури от бозайници. Получените резултати показват, че системата има потенциала да намали ръчния труд и свързаните с него грешки. В този случай процесът на измерване може да се извърши онлайн, без да се прекъсва/нарушава ферментацията.