| Приоритети: | Изобретението се отнася до медицината и ветеринарната медицина, а именно до лабораторната диагностика. Същността на метода: при изолиране на кръвни левкоцити за хемилуминесцентен анализ чрез вземане на кръв в силиконизирани епруветки, унищожаване на еритроцитите, отделяне на левкоцитната утайка чрез центрофугиране и промиване на левкоцити, кръвта се взема с Trilon B, лизисът на еритроцитите се извършва в съотношение кръв, дестилирана вода и буферен разтвор 1: 8: 1, стандартен разтвор на Ханкс без р хенол червено с добавяне на хлороформ се използва като буферен разтвор, промити левкоцити с 0,02% разтвор на трилон Б. Методът позволява да се увеличи добивът на жизнеспособни левкоцити и да се предотврати тяхното слепване. 4 табл.
Изобретението се отнася до биологията, а именно до раздела на имунологията. Може да се използва за хемилуминесцентен анализ в медицината и ветеринарната медицина.
Известен е "Метод за получаване на лимфоцитни суспензии от лимфни възли на говеда", заявка No. 810814, C 12 N 7/00, G 01 N 37/54.
Методът се провежда чрез разресване на суспензия от клетки ex tempore от тъканта на лимфните възли, разпределяне по градиента на плътност на фикол и центрофугиране за 30-40 минути, като смес от 0,0001-0,0002 n се използва като буферен разтвор. Разтвор на MgCl 2 +0,1-0,2 N. разтвор на NaCl.
Предложеният метод обаче дава възможност да се изолира само един вид „бели“ клетки, лимфоцити, и е скъп.и клане на животни.
Също известен е методът на R L. Spooner et al, Er>gt;
Взема се кръв от 0,1 М етилендиаминтетраацетат (EDTA) при рН 7,0, центрофугира се при 1500 rpm за 20 минути, след което се добавят 6 часа дестилирана вода към 1 час центрофуга за лизиране на еритроцитите. Суспензията от бели кръвни клетки се промива два пъти с 0,15 М разтвор при 200 g за 10 минути. От 1000 ml кръв се получават около 3 ml гъста суспензия от левкоцити.
Този метод на адсорбция е свързан с вземане на голямо количество кръв от животни (2000 ml за еднократна адсорбция, 10 000 ml за трикратна адсорбция на 20 ml антисерум), което се отразява неблагоприятно на състоянието на донорните животни. Освен това, когато се използва дестилирана вода за лизис на еритроцити, в левкоцитната суспензия се открива голямо количество мъртви клетки (20-30%).
От описаните в литературата най-близо до изобретението е „Метод за изолиране на суспензия от левкоцити за хемилуминесцентен анализ“, който включва вземане на кръв в силиконизирани епруветки, лизиране на еритроцити, отделяне на утайката от левкоцити чрез центрофугиране, промиване на левкоцити с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, ресуспендиране в разтвор на Ханкс, патент RU 2140432. Недостатъкът на този метод е ниският добив на жизнеспособни левкоцити.
Важна роля при бактериалните инфекции във взаимодействието на имунокомпетентните клетки играят фагоцитите, които обработват антигена (микроб, чужда клетка), превръщайки го в по-имуногенна форма и по този начин участвайки в специфичната сенсибилизация на съответните лимфоидни елементи на хуморалната и клетъчната имунна система. Необходимо е да се получи смес от полиморфонуклеарни левкоцити с преобладаване на неутрофили за използване в хемилуминесцентен анализ.
Целта на изобретението еувеличаване на добива на жизнеспособни левкоцити и предотвратяване на тяхната аглутинация.
Методът се осъществява по следния начин. Вземането на кръв с Трилон Б се извършва в силиконизирани епруветки. Разрушаването на еритроцитите се извършва чрез хипотоничен лизис при съотношение кръв, дестилирана вода и буферен разтвор 1:8:1.
Като буферен разтвор се използва стандартният разтвор на Ханкс без фенолно червено с добавяне на хлороформ:
Концентриран разтвор А
Бидестилирана вода 200 мл
Натриев хлорид (NaCl) 40,0 g
Калиев хлорид (KCl) 2,0 g
Магнезиев сулфат (MgSO 4 7H 2 O) 1,0 g
Калциев хлорид (CaCl2), разреден в
25 ml бидестилирана вода 0,7 g
Хлороформ (за консервиране) 0,5 мл
Бидестилирана вода До 250 мл
Концентриран разтвор Б
Бидестилирана вода 200 мл
Двузаместен натриев фосфат
(Na2HPO412H2O) 0.76 g
Монозаместен калиев фосфат
(KN 2 RO 4) 0,3 g
Хлороформ (за консервиране) 0,5 мл
Бидестилирана вода До 250 мл
Натриев бикарбонат (NаНСО 3 ) 1.4 g
Работният разтвор се приготвя чрез смесване на течности А + Б + бидестилирана вода в съотношение 1 част + 1 част + 18 части. Разтворът се прекарва през филтър, излива се и се автоклавира за 10 min при налягане 0,7 atm. След това се добавя течност В. Полученият разтвор на Ханкс има рН 7,4-7,6. Композицията на Ханкс е проектирана по такъв начин, че да се балансира от въздуха, а не от CO 2 .
Центрофугирайте при 1200 rpm за 15 минути. Освен това, левкоцитите се промиват с 0,02% разтвор на Trilon B.
Центрофугира се при горния режим, супернатантата се отцежда, суспензията от левкоцити се въвежда встабилизиращ разтвор. В камерата на Горяев 1% трипаново синьо определя жизнеспособността на левкоцитите, докато процентът на живите клетки трябва да бъде най-малко 90-95% при концентрация от 210 6 клетки / ml.
Отличителни черти на предложения метод са: вземането на кръв се извършва с Trilon B, лизисът на еритроцитите се извършва при съотношение кръв, дестилирана вода и буферен разтвор 1: 8: 1, като буферен разтвор се използва стандартен разтвор на Ханкс без фенолно червено с добавяне на хлороформ, левкоцитите се промиват с 0,02% разтвор на Trilon B.
Трилон Б има свойството да ускорява утаяването на еритроцитите. Допълнителното промиване на левкоцитите със стандартен разтвор на Trilon B осигурява хомогенна клетъчна суспензия, т.к. Това стандартно решение се основава на способността за свързване на калций-съдържащи комплекси. В резултат на свързването на калциеви и магнезиеви йони междуклетъчните връзки се отслабват и след това с помощта на слабо механично въздействие може да се получи хомогенна суспензия от клетки.
Предложеният стандартен разтвор на Hank без фенолно червено с добавяне на хлороформ като буфер има способността да поддържа рН (водороден индекс) на същото ниво, възстановявайки изотоничността, като по този начин осигурява благоприятна среда за левкоцитите, което спомага за повишаване на тяхната жизнеспособност.
Комбинацията от всички характеристики осигурява постигането на поставената задача, а именно увеличаването на тяхното свързване.
Таблица 1 показва сравнителна оценка на жизнеспособността на левкоцитите
Таблицата показва, че добивът на левкоцити по предложения метод е 90-95%, формираните елементи са представени от смес от полиморфонуклеарни левкоцити с преобладаване на неутрофили.
Пример 1. Взехме 0,5% разтворлакталбуминов хидролизат, получен чрез ензимна хидролиза на млечен протеин, който се получава на базата на разтвори А, Б на Ханкс чрез нагряване до точката на кипене.
Таблица 2 показва, че добивът на левкоцити при използване на 0,5% разтвор на лакталбумин хидролизат е с 5-10% по-нисък, отколкото при използване на предложения разтвор на Ханкс без фенолово червено с добавяне на хлороформ.
Таблица 3 показва, че добивът на левкоцити при използване на Hanks с фенолово червено е 5-10% по-нисък, отколкото при използване на предложения разтвор на Hanks без фенолово червено с добавяне на хлороформ.
Пример 3 Взета е среда 199 (Parker), съдържаща аминокиселини, витамини, прекурсори на нуклеинова киселина, допълнителни растежни фактори, липидни източници и разтвор на Earle, допълнен с железен нитрат.
Състав на балансиран солен разтвор на Earl, g/l:
CaCl2 (безводен) 0,20
MgSO47H2O 0.20
NaH 2 PO 4 2H 2 О 0,14
Таблица 4 показва, че добивът на жизнеспособни левкоцити при използване на среда 199 е с 5-10% по-нисък, отколкото при използване на предложения стандартен разтвор.
По този начин предлаганият метод позволява да се увеличи добивът на жизнеспособни левкоцити с 30-35% в сравнение с известните методи и предотвратява тяхното слепване.
ИСК
A method for isolating blood leukocytes for chemiluminescent analysis, including taking blood into siliconized test tubes, destroying erythrocytes, separating the leukocyte sediment by centrifugation, washing leukocytes, characterized in that blood is taken with Trilon B, erythrocyte lysis is carried out at a ratio of blood, distilled water and buffer solution 1:8:1, standard Hanks solution is used as a buffer solutionбез фенолно червено с добавяне на хлороформ, левкоцитите се промиват с 0,02% разтвор на Trilon B.
