Метод за определяне на липопротеинови фракции в кръвта при пациенти с исхемична болест на сърцето

фракции

Собственици на патент RU 2360256:

Методът се отнася до медицината и може да се използва в кардиологията. Метод за разделяне на кръвни липопротеини (LP) на фракции при пациенти с коронарна болест на сърцето (CHD), използвайки електрофореза в агарозен гел, включва третиране на кръвния серум на пациента в продължение на 1 час на тъмно при 40°C с разтвор на багрило Sudan B, добавяне на разтвор на агароза, добавяне на смес, загрята до 55°C, в ямка 4 × 20 × 10 mm от агарозен гел, след това фиксиране на електроф. ореграми, тяхното изсушаване и денситометрия. В същото време, преди лечение със Sudan B, 0,1 ml от 0,1% разтвор на Triton X-100 се добавят допълнително към 0,3 ml проба от кръвен серум на пациента и се инкубират за 15 минути при 20°C. Използването на метода позволява да се повиши чувствителността и точността на метода чрез идентифициране на незначителни фракции от кръвни липопротеини. 3 болен.

Изобретението се отнася до медицината и може да се използва в кардиологията и терапията.

Известни методи за разделяне на фракции на липопротеините (LP) на кръвта чрез метода на аналитично ултрацентрофугиране на кръв (A.N. Klimova, N.G. Nikulcheva. "Липиди, липопротеини и атеросклероза", 1995, Peter-Press, стр. 98-102) и разделяне на фракции на LP в полиакриламиден гел (N.N. Sha tskaya "Биохимични изследвания за оценка на състоянието на сърдечно-съдовата система." Към Н. "Методи на изследване в професионалната патология", М., 1988 г., стр. 95-97).

Недостатъкът на тези методи е, че те не позволяват да се открият всички фракции на кръвните липопротеини, включително HM, HDL, LDL, VLDL и LP (a), а служат за разделяне на фракции на HM, HDL, LDL, VLDL от албуминов комплекс с неестерифицирани мастни киселини.

Този метод е най-близък до предлаганата техническа същност и постигнатия резултат и е избран за прототип.

Недостатъкът на прототипния метод е ниската точност, тъй като не позволява да се идентифицират незначителни фракции от LP. Това се дължи на факта, че LP (a) фракцията е най-атерогенна и за ранната диагностика на заболяването е особено важно да се идентифицира малката LP (a) фракция, заедно с най-пълното определяне на други кръвни LP фракции.

Целта на изобретението е да се подобри точността и чувствителността на метода.

Този проблем се решава чрез фракциониране на кръвни липопротеини при пациенти с коронарна болест на сърцето (CHD) чрез електрофореза в агарозен гел чрез третиране на проба от кръвен серум на пациент за 1 час на тъмно при 40°C с разтвор на багрило Sudan B, добавяне на разтвор на агароза, добавяне на смес, затоплена до 55°C в ямка от агарозен гел с обем 4 × 20 × 10 mm, след което се фиксира при електрофореграмите и изсушаването им и денситометрия, в същото време 0,1 ml от 0,1% разтвор на Triton X-100 се добавя към 0,3 ml проба от кръвен серум на пациент и се инкубира за 15 минути при 20°C.

Новото в предложеното изобретение е допълнителната инкубация на 0,3 ml проба от кръвен серум на пациент с 0,1 ml 0,1% разтвор на детергент Triton X-100 при 20°C за 15 минути, което дава възможност за откриване на незначителни кръвни фракции на LP.

Понастоящем се обръща специално внимание на изследването на LP (a), във връзка с което се разработват лабораторни диагностични методи, които позволяват изследването на този кръвен липопротеин. Той принадлежи към apo-B-съдържащите липопротеини, богати на холестерол (CS). LP(a) е идентичен на "потъващия" pre-β-LP (потъващ pre-β-Lp), който има подвижността на pre-β-LP по време на електрофореза. LP(a) съдържат 27% протеини, 8% въглехидрати и 65% липиди, от които 59% са ECS, 14% NECS и 14% PL.

Протеиновият компонент на LP (a) е силно гликозилиран полипептид -apo(a), който има близък структурен афинитет към плазминогена, един от факторите на системата за кръвосъсирване-антикоагулация. С повишаване на концентрацията на LP(a) в кръвта, процесите на микроциркулация в кръвоносните артерии се нарушават с възможно образуване на микротромби.

Поради наличието в структурата на апо(а) сиалови киселини, LP(a) е по-отрицателно заредена в сравнение с β-LP в електрическо поле, по-добре е разтворима във вода и може да взаимодейства с метални йони (калций). Този липопротеин е хетерогенен. Всичко това свидетелства за специалната роля на LP(a) в атерогенезата.

LP(a) може да взаимодейства с LDL рецепторите, като има слаб ефект върху активността на GMC-CoA редуктазата, върху естерификацията на холестерола. Полуживотът на Lp(a) е по-дълъг от този на LDL и е 3,3 дни. Съдържанието на LP(a) в кръвта обикновено не надвишава 30 mg/l. При висока концентрация в кръвта, LP (a) се открива в местата на съдови лезии в областта на натрупване на фибриноген. Повишената концентрация на LP(a) често се комбинира с II a, II b типове хиперлипопротеинемия. Следователно в клиничната практика е изключително важно да се определи LP (a) едновременно с определянето на протеини от острата фаза на възпалението. Установено е, че повечето липидо-понижаващи лекарства не повлияват повишените нива на Lp(a). Проучванията на световната популация показват, че LP(a) е независим и независим рисков фактор за коронарна артериална болест, най-тежката проява на атеросклероза.

Фракцията LP(a) е хетерогенна. Установено е, че по време на електрофореза LP(a) се намират в областта на β-глобулините, но до 5% от LP(a) могат да бъдат открити в областта на α-глобулините.

Всичко по-горе показва изключителната важност на разработването на лабораторни диагностични методи, които позволяват най-пълното откриване на LP(a), включително незначителни фракции на LP(a).

значими знаци,характеризиращи изобретението, показани в претендираната комбинация от нови свойства, които не произтичат изрично от нивото на техниката в тази област и не са очевидни за специалист.

Идентичен набор от характеристики не беше открит при проучването на патентна и медицинска литература.

Това изобретение може да се използва в практическото здравеопазване за подобряване на точността на диагнозата при пациенти с коронарна артериална болест.

По този начин това техническо решение трябва да се счита за съответстващо на условията за патентоспособност: "Новост", "Изобретателска стъпка", "Индустриална приложимост".

Изобретението ще стане ясно от следващото описание и придружаващите чертежи.

Фигура 1 показва резултатите от електрофоретичното разделяне на LP фракции на кръвния серум: a - в контролната група по прототипния метод, b - в контролната група по предложения метод;

Фигура 2 (a, b, c) представя резултатите от електрофоретичното разделяне на фракции на LP в кръвния серум на пациенти с коронарна артериална болест (I група);

Фигура 3 представя резултатите от електрофоретичното разделяне на LP фракции на кръвния серум на пациент с коронарна артериална болест (клиничен пример): a - прототипният метод, b - предложеният метод.

Методът се изпълнява на етапи, както следва:

1) приготвяне на разтвор на Судан В: 400 mg Судан В се разтварят в 20 mg етиленгликол във вряща водна баня в продължение на 50 минути, филтрува се, съхранява се в стъклен съд;

2) приготвяне на агарозен гел: 320 mg агароза А от "Sigma" се разтварят в 20 ml вряща вода, след което се поставят в термостат при 55°С; добавете 20 ml разтвор на албумин (1 g албумин в 200 ml веронал-мединален буфер, рН 8,6). 3 ml агарозен гел се нанася върху обезмаслено хоризонтално монтирано предметно стъкло, поставено върху метална стоманапръчка с размери 4 × 20 mm (висока 10 mm), която след втвърдяване на гела се отстранява с магнит;

3) 0,1 ml от 0,1% разтвор на Triton X-100 се добавя към 0,3 ml проба от кръвен серум на пациента, инкубира се 15 минути при 20°C, добавят се 0,15 ml разтвор на Sudan B, поставя се за 1 час в тъмен термостат при 40°C, след това се добавят 0,2 ml горещ разтвор на агарозен гел, смесва се, загрява се при 55°C и се затопля ed up, поставен в ямка g смърчова агароза с размери 4×20×10 mm;

4) предметното стъкло се поставя в камерата за електрофореза с агарозен слой надолу, електрофорезата се провежда в хладилник при температура 4 ° С при напрежение 100 V и ток 40-45 mA;

5) електрофореграмата се фиксира в 5% разтвор на оцетна киселина за един час, след което се изсушава между листове филтърна хартия, като непрекъснато се намокря с 96% етилов алкохол;

6) денситометрията се извършва на микрофотометър MF-4.

В контролната група в случай на използване на прототипния метод n=10 (фиг.1а) и предложения метод n=14 (фиг.1b) разкри HM, LDL, VLDL и HDL е нормален липиден профил.

Изследвахме 2 групи пациенти с коронарна болест на сърцето: I - група (n=20) по прототипния метод и II - група (n=31) по предложения метод.

При пациенти от група I са идентифицирани II a (фиг. 2а), II b (фиг. 2b) и IV видове хиперлипопротеинемия (фиг. 2c), както и "следи" фракция на LP (a).

При пациенти от група II с хиперхолестеролемия (HCH) в диапазона 7,7-13,2 mmol/l (средна стойност 9,3±0,7 mmol/l), в допълнение към фракциите CM, HDL, LDL, VLDL, се открива интензивна LP(a) фракция, засилена от наличието на минорни LP(a) субфракции. Останалите фракции, а именно LDL, VLDL и HDL също са по-интензивни. Трябва да се помни, че в тази ситуация 5% от HDL фракцията се пада на второстепенните фракции на Lp(a).

Пациент К., 58 години: историязаболяване № 87. Той е приет в отделението по коронарна артериална болест и атеросклероза на Научноизследователския институт по кардиология, TNTs SB RAMS с оплаквания от пронизващи и стискащи болки зад гръдната кост и в областта на сърцето, които се появяват по време на тренировка, облекчени от нитроглицерин, както и с оплаквания от болка в хипохондриума, задух по време на тренировка. BP 200/110 mm Hg, пулс в покой 74 удара в минута.

Диагноза: ИБС, ангина пекторис ФК II-III; артериална хипертония.

Резултатите от лабораторните изследвания: общ холестерол - 9,3 mmol / l, триацилглицерол - 1,9 mmol / l, HDL холестерол - 0,96 mmol / l. Резултатите от електрофоретичното изследване на кръвта на този пациент по прототипния метод са представени на (фиг.3а), а по предложения метод са представени на (фиг.3b). Следи от HM, LDL, VLDL, HDL, Lp(a) бяха открити с наличието на незначителни фракции на Lp(a) в състава на HDL, както и други незначителни фракции на LP, тъй като всички идентифицирани фракции станаха много по-интензивни.

При изследването на LP в кръвния серум на пациент с коронарна болест на сърцето (CHD) съгласно прототипния метод (клиничен пример) са открити HM, β-LP (LDL), pre-β-LP (VLDL), β-LP (HDL) и „следа от фракция“ на LP(a) (фиг. 1в), а при изследването съгласно предложения метод са открити интензивни фракции на LP в зоната между β- и pre-β -LP, също повишени фракции на LDL, VLDL (фиг.1g).

Използването на предложения метод позволи да се идентифицира наличието на незначителни фракции на LP в агарозния гел при пациенти с ИБС с тежка хиперлипопротеинемия.

Използването на предложения метод за разделяне на кръвни LP фракции, за разлика от прототипния метод, позволява да се идентифицират незначителни LP(a) фракции, което повишава чувствителността и точността на метода. В същото време предложеният метод е лесен за използване и интерпретиране на получените резултати.

Метод за определяне на дробина кръвни липопротеини при пациенти с коронарна болест на сърцето с помощта на електрофореза в агарозен гел чрез третиране на проба от кръвен серум на пациент в продължение на 1 час с разтвор на багрилото Sudan B в тъмен термостат при 40°C, нагрятата смес се добавя към ямка от агарозния гел с обем 4 × 20 × 10 mm, последвано от фиксиране на електрофореграми, тяхното изсушаване и денситометрия, характеризираща се с това, че , в допълнение, преди обработката на anom B, 0,1 ml от 0,1% разтвор на Triton X-100 се добавя към 0,3 ml проба от кръвен серум на пациент и се инкубира за 15 минути при 20°C.