Метод за отглеждане на Mycobacterium tuberculosis

Собственици на патент RU 2272285:

Изобретението се отнася до медицината, а именно до лабораторни методи за диагностика на туберкулоза. В диагностичния материал, след третиране с детергент - хлорхексидин биглюконат (CHB), преди инокулация върху твърда хранителна среда, допълнително се добавя прясно приготвен воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина, съгласно 2: 1, разклаща се, центрофугира се, към утайката се добавя 1 ml среда на Школникова, след което се прехвърля в твърда хранителна среда. Методът осигурява ускорен растеж на mycobacterium tuberculosis и натрупване на бактериална маса, което е важно за диференциалната диагноза на туберкулозата. 2 табл.

Изобретението се отнася до областта на медицината, раздел "бактериология", а именно до лабораторни методи за диагностика на туберкулоза.

За да се увеличи информационното съдържание на методите за бактериологично изследване за откриване на Mycobacterium tuberculosis (MBT), се разработват методи, които повишават чувствителността на тези методи. Феромагнитни и имуномагнитни сорбенти се използват за увеличаване на честотата на откриване на MBT по време на луминесцентна микроскопия (Vladimirsky M.A., 1994). За повишаване на ефективността на метода на засяване се използва култура на храчки чрез флотация (Pottenger, 1931), електрофоретичната концентрация на микобактерии в диагностичния материал (T.F. Otten, B.I. Vishnevsky, 1986), използва се утайка от диагностичен материал (Yashchenko T.N., Mecheva IS, 1973).

По този начин търсенето на методи, които повишават чувствителността на методите за засяване за откриване на MBT в диагностичен материал в практическите лаборатории, остава актуално и има предпоставки за тяхното по-нататъшно развитие.

Съществува известен метод за отглеждане на MBT чрез засяване на утайката от диагностичен материал,обработен хлорхексидин биглюконат (В. Ф. Балан "Универсален консервант и детергент при бактериологичната диагностика на туберкулозата" // Социални и епидемиологични проблеми на туберкулозата в Далечния север - Якутск. - 1992. - С. 93). Диагностичният материал се залива с равно количество (1:1) 0,1% разтвор на хлорхексидин биглюконат (HBG). Материалът се центрофугира при 1500-2000 rpm в продължение на 10 минути, супернатантата се отцежда, като се оставят 2,0 ml за последваща инокулация върху хранителни среди.

Въпреки това, с този метод на отглеждане на Mycobacterium tuberculosis, инокулацията на MBT при инокулиране на утайката от диагностичен материал върху яйчна хранителна среда от храчка е 17,0%, според микробиологичната лаборатория на YaNIIT. Освен това, в 3,0-4,0% от случаите, поради слабия растеж на MBT културите, няма натрупване на достатъчна бактериална маса за по-нататъшна работа с изолираната култура, става необходимо да се получат субкултури и по този начин се удължава времето за издаване на резултатите от идентификацията и определянето на чувствителността към противотуберкулозни лекарства.

За да увеличим добива на биомаса от MBT култури при засяване на диагностичен материал върху хранителна среда за яйца, ние предложихме воден разтвор на ентеросорбент - хидрогелове на метилсилициева киселина (търговско наименование на лекарството - enterosgel) - за предварителна обработка на биоматериал, който допринася за концентрацията на Mycobacterium tuberculosis в проби от диагностичен материал за последващо засяване върху плътна хранителна среда. В този случай материалът (храчката) се подлага на първична обработка с цел потискане на съпътстващата микрофлора, което предотвратява заразяването на посевите. Диагностичният материал се напълва с равен обем (1:1) 0,05% разтвор на CHB. Напълно хомогенизиран. Оставете за 10-12 часапри стайна температура. На следващия ден материалът се поставя в центрофужни епруветки от 8 ml, като се добавят 2,0 ml прясно приготвен воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (ентеросгел), разклаща се на шейкър, след което се центрофугира за 15 минути, 3 хиляди оборота / мин. Супернатантата се отцежда, оставяйки утайка в епруветката, към утайката се добавя 1 ml течна среда на Школникова и се инокулира върху твърда яйчна среда Finn-2 и Levenshtein-Jensen.

Приготвяне на воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (enterosgel): 15 g хидрогелове на метилсилициева киселина (enterosgel) се стриват в стерилен хаван с 30 ml дестилирана стерилна вода до хомогенна консистенция, след което обемът се довежда до 200,0 ml. Използва се прясно приготвен разтвор. Приготвя се в стерилна кутия, при спазване на правилата за антисептика.

Бяха проведени експерименти за изследване на ефекта на воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (enterosgel) върху скоростта на поява на първичен растеж и натрупване на биомаса на културата на Mycobacterium tuberculosis върху традиционните хранителни среди Finn-2 (F-2) и Lowenstein-Jensen (LI).

В първата серия от експерименти бяха проведени тестове за доказване на сорбционния капацитет на предложеното вещество. За какво се използва небациларна храчка на пациенти. Храчките се третират предварително с 0,1% разтвор на CHB в съотношение 1:1 за 18 часа при стайна температура за втечняване и замърсяване на вторичната микрофлора. Обработеният материал се добавя по 4 ml със стерилни пипети в центрофужни епруветки, след което във всяка от тях се добавя по 1 ml от съответното разреждане на дивия МВТ щам - 5 стандарт, 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 и 10 -5 градуса. Към епруветките се добавят 2 ml воден разтвор на воден разтвор на метил силициев хидрогел.киселини (ентеросгел). Разклаща се на шейкър, след което се центрофугира за 15 минути, 3 хиляди оборота в минута. Супернатантата се декантира, оставяйки утайката в епруветката и към утайката се добавя 1 ml течна среда на Школникова. Със стерилна пипета 0,4 ml се прехвърлят в епруветки с плътна яйцесна среда Finn-2 и Lowenstein-Jensen. Инкубира се при 37°C, посевите се преглеждат ежедневно. Бяха взети предвид появата на първоначален растеж и масивността или интензивността на растежа на MBT. Резултатите от засяването са представени в таблици 1 и 2.

Както може да се види от таблица 1, върху среда F-2, при инокулиране на бактериална емулсия на стандарт MBT 5, разреждане 10-1, както в опитни, така и в контролни култури, първоначалният растеж на колониите е регистриран на 10-ия ден от наблюдението. Първоначалният растеж на МБТ от разреждане 10 -2 и 10 -3 в опитните култури се наблюдава на 10-ия ден, в контролата на 13-ия ден; първоначалният растеж от разреждане 10 -4 и 10 -5 в опитни култури се отбелязва на 13-ия ден, в контрола - на 17-ти ден.

При експериментални инокулации върху хранителна среда LI, при инокулиране на бактериална емулсия от стандарт MBT 5 и разредена 10 -1, 10 -2, 10 -3, първоначалният растеж се регистрира на 10-ия ден от наблюдението, разреждане 10 -4 и 10 -5 на 21-ия ден. При контролата също е регистрирано забавяне на появата на първоначалния растеж: 5 стандартни и 10 -1 на 13-ия ден, 10 -2 и 10 -3 на 17-ия и 10 -4 и 10 -5 на 24-ия ден от наблюдението.

По този начин беше отбелязано, че при използване на сорбент - воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (ентеросгел), появата на първоначален растеж на MBT, особено при ниска концентрация на патогена, е 3-4 дни по-рано, отколкото при контролните култури.

Индикаторите за масивност или интензивност на растеж на MBT върху хранителни среди са показани в таблица 2.

При сеитба върху хранителни среди F-2 и LI MBT 5 стандарт и интензитетът му на разреждане (10 -1, 10 -2, 10 -3)растежът в контролните и опитните култури не се различава. Но при засяване на разреждане от 10 -4 и 10 -5 в експеримента върху двете използвани среди, броят на колониите беше по-голям и във всички случаи бяха регистрирани по-големи колонии. Тези. имаше натрупване и увеличаване на добива на MBT биомаса.

Воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (ентеросгел) е тестван върху диагностичен материал от 172 пациенти. От 172 опитни култури, 53 (30,8%) положителни култури (MBT+), 45 (26,0%) са положителни (MBT+) в контролата, т.е. има увеличение при посевите на МБТ с 4,8%.

Първоначалният растеж на MBT в опитните посеви се регистрира средно на ден 20 + 2, интензивен на ден 27 + 1.8. При контролните посеви началният растеж е отчетен при 26 + 1,5, а интензивен на 32-ия ден.

При сравняване на масивността на растежа на MBT в контрола и експеримента - върху среда с използване на воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (ентеросгел), се отбелязва по-голямо натрупване на биомаса на MBT.

Получените резултати показват, че използването на сорбент - воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина (ентеросгел) е ефективен начин за отглеждане на MBT върху плътни хранителни среди, допринася за оптималното натрупване на бактериална маса, което е от основно значение за диференциалната диагноза на колониите на MBT и по-нататъшната работа с отглеждани култури.

Таблица 1 Регистриране на първичен растеж на MBT върху F-2 и LI среда (дни)
Разреждания\дни	5 ст.	10 -1	10-2	10-3	10-4	10-5
F-2	LI	F-2	LI	F-2	LI	F-2	LI	F-2	LI	F-2	LI
опитен	10	10	10	10	10	10	10	10	13	21	13	21
контрол.	10	13	10	13	13	17	13	17	17	24	17	24

Таблица 2 Регистриране на масивността (интензивността) на растежа на MBT

Разреждания\дни

5 ст.

10 -1

10-2

10-3

10-4

10-5

F-2

опитен

>100

До 100

тридесет

контрол.

>100

До 100

тридесет

Метод за отглеждане на Mycobacterium tuberculosis (MBT) чрез третиране на храчките на пациента с разтвор на хлорхексидин биглюконат (CHB), засяване на диагностичния материал върху плътна яйчна хранителна среда, характеризиращ се с това, че след третиране с CHB към материала се добавя прясно приготвен воден разтвор на хидрогелове на метилсилициева киселина в съотношение 2: 1, разклаща се, след това се центрофугира в продължение на 15 минути, 1 ml от течната среда на Школни се добавя към утайката, след което се прехвърля в плътна хранителна среда.