Метод за получаване на убихинон
Употреба: биотехнология, медицина за лечение на редица заболявания, както и реактив в научните изследвания. Същността на изобретението: Cryptococcas curvatus VKM 2230 се отглежда върху среда, съдържаща суроватка като основен компонент, мащабен производствен отпадък, с допълнително въвеждане на глюкоза, етанол и амониеви соли в средата, като същевременно се намалява съдържанието на скъп екстракт от дрожди 2-4 пъти. Изключването на екстракт от царевица от състава на средата позволи да се увеличи добивът на биомаса, да се увеличи количеството на убихинон-10 в 1 литър културална течност с 1,17 - 2,35 пъти, като същевременно се намали цената на средата с 1,5 - 2,5 пъти в сравнение с известния метод.
Изобретението се отнася до микробиологичната индустрия, а именно до метод за получаване на убихинон-10 (коензим О10), използван в медицината за лечение на редица заболявания, а също и като реагент в научните изследвания.
Известни методи за производство на убихинон-10 с помощта на дрожди от реката. Р. Сandida, Rhodotorula, Torulopsis, Sporidiobolus и др., включващи култивиране на дрожди при периодични условия върху среда, съдържаща глюкоза с екстракти от дрожди и царевица и минерални соли при аеробни условия [1,2].
Най-близо до претендираното техническо решение е метод за производство на убихинон-10 с помощта на култура от Сryptococcus curvatus VKM 2230, която при отглеждане върху среда, съдържаща екстракти от глюкоза (3%), дрожди (0,4%) и царевица (0,1%), минерални източници на азот, фосфор, някои минерални соли и етанол (2% обемни), натрупва убихинон-10 в количество от 0,5-0,6 mg/g суха биомаса, максимално натрупване на убихинон-10в 1 литър културална течност е 4,02 mg, със съдържание на биомаса в средата 6,7 g [3].
Недостатъците на този метод са ниският добив на биомаса, ниското натрупване на убихинон-10 в 1 литър културална течност и високата цена на 1 литър среда поради големи количества скъп екстракт от дрожди във ферментационната среда.
Целта на изобретението е да увеличи добива на биомаса, да увеличи добива на убихинон-10 от 1 литър културална течност, да намали цената на ферментационната среда.
Това се постига чрез култивиране на дрождите C.curvatus VKM 2230 при аеробни условия върху среда, съдържаща 40-56% суроватка като основен компонент, 0,1-0,2% екстракт от дрожди, минерални източници на азот, фосфор, някои минерални соли, докато по време на процеса на ферментация се добавя глюкоза, за да се поддържа концентрацията й в средата в рамките на 1,2-2,6%, сулфат или амониев хлорид 0,05-0,3%, а 10-25 часа преди края на ферментацията се добавят 3-5% (по обем) етанол.
Допълнително въвеждане на амониев сулфат или хлорид 0,05-0,3% е необходимо, за да се осигури определено ниво на стойности на рН в диапазона от 2,7-3,2, при което се наблюдава увеличение на съдържанието на убихинон-10 в биомасата, ако концентрацията на глюкоза в средата е в горните граници. Въвеждането на по-малки количества амониеви соли не води до желания ефект, големи количества амониеви соли - непрактично.
Намаляването на pH на средата поради добавянето на неорганични киселини не води до увеличаване на количеството убихинон-10. Добавянето на етанол 3-5% обемни 10-25 часа преди края на ферментацията е необходимо за инхибиране на растежа на културата и повишаване на специфичното съдържание на убихинон-10 в биомасата. Добавянето на етанол в по-малки количества е неефективно, тъй като етанолът се разпада бързоокислени. Добавянето му в големи количества е непрактично, тъй като ефектът е същият като при добавяне на 5%.
Методът е следният.
Културата на дрожди Cryptococcus curvatus VKM 2230 се отглежда върху среда със следния състав, %: суроватка 40-56 (по обем); амониев сулфат или амониев хлорид 0,1-0,5; монозаместен калиев фосфат 0,2-0,5; магнезиев сулфат 0,05-0,1; железен сулфат 0,001; цинков сулфат 0,0001; екстракт от дрожди 0,1-0,2; pH преди стерилизация 4,7-5,4; чешмяна вода до 6 литра. Ферментацията се извършва в апарат Biofer с обем 10 l с 6 l среда, с подаване на въздух 1: 2 (V : V), скорост на бъркалка 900-1000 rpm, температура 28 ° C. По време на ферментацията към културалната течност се добавя глюкоза, за да се поддържа концентрацията й в средата на ниво 1,2-2,6%, амониев сулфат или хлорид 0,05-0. 3%. 10-25 часа преди края на ферментацията се добавя етанол 3-5% обемни. Процесът на ферментация се извършва в продължение на 65-72 часа.В края на ферментацията клетките се отделят в центрофуга на 5000 хил. об./мин. Добивът на биомаса е 60-116 g/l с влажност 70-82%. Определянето на количеството убихинон-10 в биомасата на дрождите се извършва по модифициран метод, описан за определяне на коензим О10 в биомасата на оцетнокисели бактерии. За изолиране на убихиноновата фракция се използва TLC върху Silufol UV-254 плаки в системата хексан:етер (3:1). Съдържанието на убихинон-10 в дрождената биомаса е 0,2-0,5 mg/g суха биомаса (SB). Общото количество на убихинон-10 с 1 литър културална течност е 4,7-9,67 mg/l, което е 1,17-2,4 пъти по-високо от количеството на убихинон-10, получено с 1 литър културална течност в прототипа.
PRI me R 1. Дрожди Сryptococcus curvatus VKM 2230 се отглеждат в 10 l апарат, съдържащ 6 l среда със следния състав, %:суроватка 46 (по обем); амониев сулфат 0,3; монозаместен калиев фосфат 0,5; екстракт от дрожди 0,23; магнезиев сулфат 0,1; железен сулфат 0,001; цинков сулфат 0,0001; pH 4,8; чешмяна вода до 6 литра. Ферментацията се провежда при 281°C, подаване на въздух 1:2 (V : V), разбъркване 900 rpm. Глюкозата се добавя след 23 и 48 часа от началото на ферментацията, по 90 g, амониев сулфат 10 g след 48 часа, етанол 300 ml след 53 часа.Промени в концентрациите на глюкоза по време на ферментацията се наблюдават в диапазона от 1,2-2,35%. След 68 часа количеството на биомасата е 116 g/l при съдържание на влага 78%. Количеството убихинон-10 в 1 g мокри клетки е 0,048 mg. Количеството убихинон-10 в 1 g културална течност е 5,57 mg/l, което е 1,35 пъти по-високо от прототипа.
ПРИМЕР 6. Съставът на ферментационната среда се различава от дадения в пример 1 с количеството амониев сулфат 0,5%, количеството на дрождения екстракт 0,1% и началното рН 4,85. Глюкоза, по 90 g, се въвежда по време на ферментационния процес след 25 и 35 ч. Концентрацията на глюкоза в средата варира в рамките на 1,22-2,28%. 300 ml етанол се добавят след 45 часа След 70 часа от началото на ферментацията се събират 60 g мокри клетки от 1 литър културална течност със съдържание на влага 71%. Съдържанието на убихинон-10 в 1 литър културална течност е 6,18 mg, което е 1,5 пъти по-високо, отколкото в прототипа.
П р и м е р 7. Дрожди Сryptocoсcus curvatus VKM 2230 се отглеждат в апарат V=10 l, съдържащ 6 l среда със следния състав, %: суроватка 46 (об.); (NH4)2SO4 0,5; KH2PO4 0,5; екстракт от дрожди 0,1; MgSO4 0,1; FeSO4 0,0001; ZnSO4 0,0001; pH 4,85. Чешмяна вода до 6 литра. Ферментацията се провежда при 28°С, подаване на въздух 1:2 (V:V), разбъркване 900 rpm. Глюкоза, по 90 g всяка, се добавя по време на ферментацията след 25 и 35 часа.в средата варира в рамките на 1,22-2,28%. След 45 часа се добавят етанол 300 ml и амониев хлорид 3 g. След 70 часа от началото на ферментацията се събират 60 g мокри клетки от 1 литър културална течност със съдържание на влага 71%. Съдържанието на убихинон-10 в 1 литър културална течност е 6,18 mg, което е 1,5 пъти по-високо, отколкото в прототипа.
МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА УБИХИНОН - 10, включващ култивиране на продуциращ микроорганизъм - щам дрожди Cryptococcus curvatus VKM 2230 при аеробни условия в присъствието на източник на въглерод, минерални източници на азот, фосфор, глюкоза, екстракт от дрожди, етанол, характеризиращ се с това, че за увеличаване на добива на биомаса се увеличава съдържанието на ubi хинон и намаляване на цената на средата, суроватката се използва като източник на въглерод, по време на култивирането се въвежда глюкоза, като се поддържа концентрацията й от 1,2 до 2,6 тегл.% и допълнително сулфат или амониев хлорид в концентрация от 0,05 до 0,3 тегл.%, а етанолът се добавя 10 до 25 часа преди края на култивирането в концентрация от 3 до 5 тегл.%.