Методиката на урока и методически указания по темата
Тема 3. Индикация на вируси в патологичен материал за откриване на вириони и вирусни включени тела
Задача за следващия урок
Обобщаване на урока
Тестови въпроси:
1. Какви са общите правила за вземане на материал от болни животни и трупове?
2. Как се съхранява и транспортира патологичният материал?
3. Какво знаете за подготовката на патологичен материал за изследване?
Оборудване и материали: светлинни микроскопи, виброгар-съдържащ материал, предметни стъкла, спиртни лампи, филтърна хартия, ексикатори, мостове, промивки с дестилирана вода, пясъчни часовници, течност Ruge, оцветител, разтвор на амонячно сребърно багрило, електронни и луминесцентни микроскопи, схема на структурата на електронен микроскоп, снимки на вируси под електронен микроскоп, фоторепродукции на вируси в областта на флуоресцентен микроскоп (RIF), мултимедийно оборудване,MS Office Power Pointпрезентации и постери, свързани с урока.
Обяснение на учителя: Вирусите, открити в живите клетки на едноклетъчни и многоклетъчни организми, най-често се представят като клъстери от несвързани молекули (или части от молекули) на РНК или ДНК, в които е кодирана генетична информация за вирусни протеини. В резултат на реализацията на тази информация в същите клетки се синтезират и натрупват молекули на вирусни протеини. Вътре в клетките всички вирусни молекули (ДНК, РНК, протеини) са защитени от разрушителното действие на извънклетъчните фактори (ензими, киселини, температура, радиация и др.). Ако вирусите са извън клетките,бързо се унищожават.
3.1 Методи за директно откриване на вируса в тестовия материал. Много вирусни протеини, които се наричат структурни протеини, имат свойството спонтанно да се събират в бучки, агрегати (процес на самосглобяване) под действието на междумолекулни сили. Всеки такъв агрегат обикновено включва една молекула вирусна ДНК или РНК. Понякога те могат да включват и липиди от клетъчен произход. Образуваните по този начин частици се наричат вириони. Във вирионите протеиновите молекули са толкова взаимно ориентирани, че протеолитичните ензими не могат да действат върху тях, а вирусните ДНК или РНК молекули са недостъпни за нуклеазите и са защитени от физически фактори на околната среда. Образуването на вириони на всеки отделен вирус е възможно само в клетки от определен тип.
Вирионите могат да се разглеждат като спяща неактивна форма на съществуване на вируси. Следователно, под формата на вириони, вирусите могат да останат извън клетките за определено време без загуба на биологична активност.
Големите вируси (едра шарка, ектима), видими в системата за потапяне на светлинен микроскоп, се наричат елементарни тела.
Вътреклетъчните включващи телца са фрагменти от натрупвания на вирусни частици или продукт на реакцията на клетката към вирусна инфекция. Класифицират се според мястото на локализация в клетката, според хомогенността, според състава на нуклеиновата киселина, според тинкториалните свойства.
При редица вирусни инфекции откриването на телца на включване има диагностична стойност. Много от тях са толкова характерни, че откриването им се е превърнало в един от основните експресни методи за диагностика на бяс, едра шарка, ринопневмония по конете и ринотрахеит по говедата.
3.2 Методи за оцветяване на вириони. Има много методи за оцветяване на петна, петна - отпечатъци. от най-многоМетодът на оцветяване по Морозов е често срещан. Методът на оцветяване е прост, не изисква оскъдни реактиви, можем да го направим в класната стая.
Приготвените петна се изсушават на въздух, поставят се във вертикално положение в дестилирана вода за 10-15 минути и се оцветяват. Приготвят се три реактива за оцветяване по Морозов.
1) Течност Ruge.
3) оцветяващ разтвор на амонячно сребро.
Помислете за лекарството в системата за потапяне. Елементарните тела на светлокафяв фон на препарата изглеждат като тъмнокафяви почти черни малки зърна, образувания.
Телата на включване, образувани от редица вируси, са получили специални имена. И така, цитоплазмените тела - включвания, образувани в нервните клетки на бозайниците от вируса на бяс, се наричат тела на Бабеш-Негри, в епителните клетки на овцете - от вируса на овча шарка - тела на Борел, от вируса на варицела - тела на Болинджър. По правило РНК-съдържащите вируси образуват цитоплазмени, а ДНК-съдържащите вируси образуват интрануклеарни телца за включване.Малка група вируси причиняват образуването на двата вида телца за включване. Телата на Бабеш-Негри са придобили най-голямо практическо значение при диагностицирането на бяс. Хистологичните срезове се приготвят от парчета от определени части на мозъка (Амоновите рога, малкия мозък, продълговатия мозък). Получените препарати се оцветяват по метода на Муромцев, Туревич, Селерс и др. Всеки метод на оцветяване дава своя характерна картина.
3.3 Конструкция и принципи на работа на електронни и луминесцентни микроскопи. При всяко микроизследване е необходима точна информация за морфологичните особености на интересуващия ни организъм. Тази информация не може да бъде получена по друг начин,освен чрез изследване на даден организъм под микроскоп. Това прави микроскопа основен инструмент запрактическото изучаване на микроорганизмите и запознаването с него е първото условие за успех в тази работа.
Целта на различните видове микроскопия е по-нататъшното изследване на морфологията на вирусите и диференциалната диагноза на инфекциозните заболявания. Според схемата на структурата електронният микроскоп е подобен на светлинния. За разлика от светлината в електронните микроскопи, изображението се получава с помощта на поток от електрони.
За да се предотврати поглъщането на електрони от въздуха, въздухът се изпомпва от микроскопа с вакуумна помпа.
Основните части на микроскопа: колона, контролен панел, пишещо устройство, вакуумна система, свързващи кабели. Маслените и дифузните помпи са разположени в долната част на електронния микроскоп.
Максималната разделителна способност на електронния микроскоп е 2А°. Според естеството на изследването на обектите се разграничават микроскопи от трансмисионен тип, сканиране, излъчване и сянка.
При работа с електронен микроскоп е важна подготовката на препаратите. За трансмисионен електронен микроскоп обектите за изследване трябва да бъдат под формата на тънки срезове или вирусни суспензии. Обектите се поставят върху медни решетки с подложки.
3.4 Методи за приготвяне: метод на отрицателен контраст, метод на отпечатване, метод на разпръскване, ултрафин методфилийки.
Материалът за електронно микроскопско изследване на вируси може да бъде тампони от лигавици, чревно съдържимо, кожни лезии, корички, парчета органи и тъкани, алантоична течност от пилешки ембриони, течност от клетъчна култура, съдържаща виболгар. При приготвянето на препарати голямо значение има концентрацията на вируса в материала и степента на заразеност с баластни вещества. В зависимост от тези фактори се избира методът за подготовка на изходния материал.
С помощта на електронен микроскоп в някои случаи за няколко минути може да се определи таксономичната позиция на вируса по морфологията на вирусните частици.
Методът на имунофлуоресценцията се нарича още RIF, методът на белязаните антитела.
Принципът на RIF се основава на използването на явлението флуоресценция, което се състои в излъчване на светлина от атоми на вещество, които са абсорбирали излишната външна енергия и са в състояние на възбуда. В този случай се използва флуоресцентна микроскопия (фиг. 7)
Фигура 7. Луминесцентен микроскоп ML-2
При диагностични изследвания по метода RIF като обект на изследване могат да се използват петна - отпечатъци, срезове от органи и тъкани, изстъргвания, хистологични срезове, препарати от тъканни култури.
При директния RIF метод цитонамазката-отпечатък се третира със серум, маркиран с антитела, хомоложни на вируса, който се предполага, че присъства. Ако цитонамазката съдържа антиген, хомоложен на серумните антитела, тогава се образува комплекс антиген + антитяло. Препаратите се измиват, изсушават и изследват под флуоресцентен микроскоп, който е проектиран така, че върху препарата да попада сноп синьо-виолетови лъчи, а в окото на наблюдателя да влизат само жълто-зелени лъчи, излъчвани от комплекса антиген + антитяло. Ето защолуминесценция и преценка за наличието в материала на антигени, хомоложни на антителата на белязания серум.
Индиректният метод се състои в това, че намазката-отпечатък се обработва два пъти: първо с небелязан антивирусен серум, а след това след измиване с маркиран антивидов серум. След второто измиване препаратът се изсушава и се изследва под флуоресцентен микроскоп. Откриването на специфична флуоресценция в препарата показва наличието в материала на антигени, хомоложни на използвания антивирусен серум.
По ефективност индиректният метод има предимства пред директния.
Като цяло методът на флуоресцентните антитела има редица предимства пред другите методи.
Не намерихте това, което търсихте? Използвайте търсачката: