МИОГЛОБИН И МИТОХОНДРИИ ОКСИМИОГЛОБИН ВЗАИМОДЕЙСТВУВА С МИТОХОНДРИИ В ПРОЦЕСА НА ДЕЗОКСИГЕНАЦИЯ
Цена:
Автори на произведението:
Научно списание:
Година на издаване:
МИОГЛОБИН И МИТОХОНДРИЯ: ОКСИМИОГЛОБИН ВЗАИМОДЕЙСТВУВА С МИТОХОНДРИАЛНАТА МЕМБРАНА В ПРОЦЕСА НА ДЕЗОКСИГЕНАЦИЯ
БИОХИМИЯ, 2009, том 74, бр. 11, стр. 1488 - 1497 г
МИОГЛОБИН И МИТОХОНДРИЯ: ОКСИМИОГЛОБИН ВЗАИМОДЕЙСТВУВА С МИТОХОНДРИАЛНАТА МЕМБРАНА В ПРОЦЕСА НА ДЕЗОКСИГЕНАЦИЯ
Получено на 28 април 2008 г. Преработено на 10 април 2009 г
При стандартни условия, скоростите на поглъщане на O2 от митохондриите (MC) от черен дроб на плъх, естествен, несвързан с FCCP и прясно замразен, и двата без оксимиоглобин (V0) и в присъствието на 0,11–0,25 mM MbO2 разтвор на кашалот (K1), бяха измерени полярографски при стандартни условия. При същите условия, скоростта на MbO2 деоксигениране в присъствието на MQ (V2) се записва спектрофотометрично. За прясно замразени MX при pH 5.6–7.6 е изследвана зависимостта на V1 и V2 от заряда на миоглобина, а при pH 7.4 е изследван ефектът върху V1 и V2 на редица други различно заредени протеини, като apo-Mb, лакталбумин, яйчен лизозим и BSA. Установено е, че в присъствието на MbO2 скоростта на дишане на естествени и замразени Mcs се ускорява с 10–30% (Vj> V0), но ефектът липсва в случай на Mcs, несвързан от FCCP, т.е. MbO2 не влияе на максималната скорост на потребление на O2. Скоростта на деоксигениране на MbO2 в присъствието на различни MX препарати напълно съвпада със скоростта на тяхното потребление на O2 (V2/V1
1 при pH 7,2–7,5). Стойностите на V2/V1 нарастват при pH 13 mm Hg, този принос се оказва пренебрежимо малък, а при по-ниски стойности на PO2 е само 1,5–4% [12, 15]. Изчисленията, използващи наскоро намерената стойност на DMb за сърцето на мишката [16], която е приблизително 3 пъти по-висока от стойността на DMb за скелетните мускули, въпреки това показват, че дори сPO2 = 1,8 mm Hg и 0,2 mM концентрация на MbO2, приносите на свободния кислород и O2, свързани с миоглобина, са еднакви.
По този начин ефективното функциониране на Mb чрез механизмите на "кислородно депо" и "улеснена дифузия" е много проблематично. И двата механизма не предполагат никакво взаимодействие на протеина с клетъчните структури.
rams или метаболити (формулирани в рамките на хомогенна термодинамика и кинетика), така че афинитетът на миоглобина към 02 във всички моделни изчисления се приема за постоянен. Разбирането на истинския механизъм на функциониране на Mb в клетката и неговата роля в доставянето на O2 до MCh е не само важно за решаването на фундаменталния проблем на молекулярната биология и биохимия, но също така е много важно в приложен аспект. При проектирането на инсталации за отглеждане на клетъчни култури е необходимо да се създадат най-добрите условия за тяхното снабдяване с O2.Съответно при математическото моделиране на тези процеси е необходимо правилно да се оцени приносът на Mb и необходимостта от въвеждане на гени и клетки, способни да го експресират в културата [17].
По-рано показахме [18], че разцепването на 02 от Mb02 при физиологични стойности на PO2 е възможно само при директен контакт на протеина с митохондриите. Ако дишащите МС са отделени от разтвора на MbO2 чрез полупропусклива мембрана, тогава дори при концентрация на O2, близка до нула, не се наблюдава деоксигениране на MbO2. По този начин процесът на деоксигениране на Mb02 в клетката трябва да включва активно взаимодействие на протеина с митохондриалната мембрана, което трябва да доведе до намаляване на неговия афинитет към лиганда.
Целта на тази работа е да се проучи природата на това взаимодействие. Тъй като външната мембрана на митохондриите е отрицателно заредена и 50% от нейната повърхност е заета от протеини, ефектът върху скоростта на деоксигениране на MbO2 (K2), измерен чрезспектрофотометрично, общият заряд на миоглобина на кашалота (p1 8.3) и химически модифицирания CM-MO2 (p1 5.2), карбоксиметилиран при хистидини, при pH 5.6-7.6. За да оценим ролята на електростатичните взаимодействия в системата, ние също проучихме скоростта на деоксигениране на MbO2 в присъствието на други протеини, отрицателно зареден мономерен лакталбумин (p1 4.4) и тетрамерен BSA (p1 4.7) и положително зареден яйчен лизозим (p1 11). За да тестваме MX мембраната за наличие на миоглобин-специфични протеини, канали или региони от фосфолипиди, ние също проучихме ефекта върху U2 на апомиоглобин, който е структурно хомоложен на холопротеина, но не свързва O 2. В допълнение, скоростите на поглъщане на O 2 от разтвора от митохондриите на черния дроб на плъх, нативни, несвързани с BSSR и прясно замразени при различни условия, без о ксимиоглобин (¥ 0) и в присъствието на 0,11-0,25 mM разтвор на MbO2 от кашалот и различни протеини (V1).
Материали. Митохондриите се изолират от черен дроб на плъх, като се използва стандартен метод, използващ диференциално центрофугиране в среда, съдържаща 220 mM манитол, 70 mM захароза, 5 mM Hepes, 1 mM EGTA, рН 7.4. Окончателното центрофугиране се извършва при 3000 g за 15 минути (утаяват се само големи непокътнати MC). Използвахме прясно изолиран естествен конюгиран MCh с минималната скорост на дишане на сукцинат (Vmin), бързо замразен при –18°C и размразен веднъж, както и естествен MCh, несвързан с FCCP (0,5 µM), с максимална скорост на дишане на сукцинат (Vmax); Vmax/ V . = 4 5-6 5
Метмиоглобин (meth-Mb) от скелетен мускул на кашалот (17,8 kDa, фракция IV) се получава и пречиства, както е описано по-горе [19]. Оксимиоглобин (окси-Mb) се получава при аеробни условия чрез редуциране на met-Mb с натриев дитионит, коетослед това се разделят чрез гел филтрация върху колона Sephadex G-25.
Кашалот, карбоксиметилиран при хистидинови остатъци (CM-Mb), се приготвя с 0,2 М натриев бромоацетат. Реакцията се провежда в 0.1
За по-нататъшно четене на статията трябва да закупите пълния текст. Артикулите се изпращат във форматPDFна пощата, посочена при плащането. Времето за доставка епо-малко от 10 минути. Цената на една статия е150 рубли.
Подобни научни трудове на тема "Химия"
Г. Б. Постникова, Е. А. Шеховцова — 2012 г
П. А. Григориев, Г. Б. Постникова, Е. А. Шеховцова — 2012 г