Обща характеристика на методите за определяне на чувствителността на микроорганизмите към ABP

Съвременните стандартизирани методи за определяне на чувствителността на микроорганизмите към ABP се разделят на методи на серийно разреждане и методи на дифузия.

Методите за серийни разреждания се основават на директното определяне на основния количествен показател, характеризиращ микробиологичната активност на ABP - стойността на неговата минимална инхибираща концентрация (IPC).

MIC - минималната концентрация, която потиска видимия растеж на изследвания микроорганизъм в бульонна култура или върху твърда среда.

За да се определи MIC, дадените концентрации на ABP се въвеждат в хранителна среда, която след това се инокулира с култура на изследвания микроорганизъм и след инкубацията се оценява наличието или отсъствието на видим растеж.

В зависимост от естеството на използваната хранителна среда има методи за серийни разреждания в агар или в бульон. В зависимост от обема на използваната течна хранителна среда се разграничават методите на серийни макро- и микроразреждания.

Разновидност на метода на серийно разреждане също е метод, основан на използването само на две концентрации на ABP, съответстващи на граничните точки на MIC (вижте по-долу). Този принцип на изследване намира широко приложение в автоматизираните системи за определяне на чувствителността на микроорганизмите.

Дифузионните методи за определяне на чувствителността се основават на дифузията на ABP от носителя в плътна хранителна среда и потискането на растежа на изследваната култура в зоната, където концентрацията на ABP надвишава MIC.

В момента има две основни модификации на дифузионния метод: дискова дифузия и Е-тест.

Е-тестът представлява тясна лента от полимер (0,5 х 6,0 cm), върху която се нанася градиент на концентрациите на ABP (от минимум към максимум).Потискането на растежа на микроорганизма около Е-тест лентата се случва само в зоната, където концентрацията на ABP, дифундираща от носителя, е по-висока от MIC и се образува капкообразна зона на инхибиране. Стойностите на концентрацията на ABP във всяка област на носителя са типографски отпечатани върху външната (с лице към изследователя) повърхност на Е-теста. Стойността на IPC се взема предвид на мястото, където границата на зоната на потискане на растежа се доближава до средата. Подробни инструкции за определяне на чувствителността с помощта на Е-тестове се доставят от производителя с комплекта реактиви и следователно подробностите за метода няма да бъдат обсъждани.

Основните етапи на тестването

Оценката на антибиотичната чувствителност, независимо от конкретния метод, включва последователно изпълнение на няколко етапа:

подготовка на хранителни среди;
приготвяне на суспензия от изследваните микроорганизми (инокулум);
инокулация;
инкубация;
отчитане и интерпретация на резултатите, формулиране на препоръки за лечение.

Дифузионните методи също включват етапа на нанасяне на дискове или ленти от Е-теста върху плътна хранителна среда.

Подготовка на хранителна среда за изследване на чувствителността

За оценка на чувствителността е необходимо да се използват само специално разработени за тази цел среди, които по своите характеристики отговарят на изискванията, дадени в раздел 5. Вътрешнолабораторният контрол на качеството на средата трябва да се извършва с всички известни налични в търговската мрежа хранителни среди (Muller-Hinton, Isosensitest, AGV и др.) независимо от техния производител.

Видът на хранителната среда за оценка на чувствителността се определя от избрания метод за провеждане на изследването (агар или бульон), както и вида на тестамикроорганизъм.

Избраната културална среда за тестване на чувствителността се приготвя от търговска суха среда в съответствие с инструкциите на производителя. След автоклавиране хранителната среда незабавно се излива в стерилни епруветки или петриеви панички или (ако е необходимо) колбите със средата се поставят във водна баня при 48–50 °C, където се държат до достигане на определената температура, след което асептично към тях се добавят термолабилни хранителни добавки и/или антибиотични работни разтвори и след това се изсипват в епруветки или петриеви панички.

Агарът се изсипва в плочи със слой с дебелина 4 mm (25 ml агар са необходими за 100 mm плоча, 20 ml за 90 mm плоча). Чашите се оставят на стайна температура да стегнат. За предпочитане е така приготвените петриеви блюда да се използват веднага. Разрешено е да се съхранява в запечатани найлонови торбички в хладилник при + 4 - + 8 ° С в продължение на 5 дни.

Приготвяне на суспензия от изследваните микроорганизми (инокулум)

Общо и фундаментално важно за всички методи за изследване е стандартизирането на суспензията на изследвания микроорганизъм, концентрацията му трябва да бъде 1,5 х 10 8 CFU/ml. На практика най-приемливият метод за оценка на концентрацията на бактериална суспензия е измерването на нейната оптична плътност. Оптичната плътност на бактериалната суспензия с концентрация 1,5 х 108 CFU/ml, когато се контролира визуално, съответства на стандарта за мътност от 0,5 по McFarland. Контролът на оптичната плътност на суспензията може да се извърши и спектрофотометрично (денситометрично). Има налични в търговската мрежа стандарти за мътност и спектрофотометри. Бактериалната суспензия може да се приготви или от бульон, или от агар.

готвенеинокулум от агарова култура

За приготвяне на инокулума се използва чиста дневна култура от микроорганизми, отглеждани върху плътни хранителни среди. Изберете няколко еднотипни, ясно изолирани колонии, отглеждани върху неселективна плътна хранителна среда. Прехвърлете с примка малко количество материал от върховете на колониите в епруветка със стерилен физиологичен разтвор или хранителен бульон, като плътността на инокулума достигне точно 0,5 според стандарта McFarland. Инокулумът трябва да се използва в рамките на 15 минути след приготвянето.

Приготвяне на инокулум от бульонна култура

При определяне на чувствителността на бързо растящи бактерии с нормални хранителни изисквания може да се използва и 5 до 6-часова бульонна култура на микроорганизма за приготвяне на инокулума. За да направите това, се избират няколко подобни изолирани колонии, малко количество материал се прехвърля с бримка в епруветка с 4,0 - 5,0 ml течна неселективна хранителна среда. Инкубирайте при 35°C. След около 5 до 6 часа инкубация, плътността на микробната суспензия приблизително съответства на желаната и се регулира прецизно до 0,5 McFarland чрез добавяне на стерилен бульон или физиологичен разтвор.

Стандартът на McFarland може да бъде закупен от търговски източници или приготвен в лаборатория.