Основни методи за изследване на цитокините

Преглед на използваните в момента методи за оценка на цитокини: техните възможности и предназначение. Описание на предимствата и недостатъците на различни методи за подходи към анализа на експресията на цитокинов ген на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини.

Изпратете добрата си работа в базата знания е лесно. Използвайте формата по-долу

Студенти, докторанти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще ви бъдат много благодарни.

Публикувано наhttp://www.allbest.ru/

основни методи за изследване на цитокини

цитокинова генна техника

Резюмето е посветено на основните методи за изследване на цитокини, използвани в момента. Накратко се характеризират възможностите и предназначението на методите. Представени са предимствата и недостатъците на различни подходи за анализ на експресията на цитокинов ген на ниво нуклеинови киселини и на ниво производство на протеини.

Цитокините са регулаторни протеини, които образуват универсална мрежа от медиатори, характерни както за имунната система, така и за клетките на други органи и тъкани. Под контрола на този клас регулаторни протеини се случват всички клетъчни събития: пролиферация, диференциация, апоптоза и специализирана функционална активност на клетките. Ефектите на всеки цитокин върху клетките се характеризират с плейотропия, спектърът от ефекти на различните медиатори се припокрива и като цяло крайното функционално състояние на клетката зависи от влиянието на няколко цитокини, действащи синергично. Така цитокиновата система е универсална, полиморфна регулаторна мрежа от медиатори, предназначена да контролира процесите на пролиферация, диференциация, апоптоза и функционална активност на клетъчните елементи вхемопоетични, имунни и други хомеостатични системи на тялото.

Измина малко време от описанието на първите цитокини. Въпреки това, тяхното изследване доведе до разпределянето на обширна част от знанието - цитокинология, която е неразделна част от различни области на знанието и на първо място имунологията, която даде мощен тласък на изучаването на тези медиатори. Цитокинологията прониква във всички клинични дисциплини, вариращи от етиологията и патогенезата на заболяванията до профилактиката и лечението на различни патологични състояния. Следователно, изследователите и клиницистите трябва да се ориентират в разнообразието от регулаторни молекули и да имат ясно разбиране за ролята на всеки от цитокините в процесите, които се изследват.

Определяне на биологичната активност на цитокините

Историята на откритието и първите стъпки в изследването на цитокините е тясно свързана с култивирането на имунокомпетентни клетки и клетъчни линии. Тогава бяха показани регулаторните ефекти (биологична активност) на редица разтворими протеинови фактори върху пролиферативната активност на лимфоцитите, върху синтеза на имуноглобулини и върху развитието на имунни отговори в in vitro модели. Един от първите методи

определяне на биологичната активност на медиаторите - определяне на фактора на миграцията на човешки лимфоцити и фактора на неговото инхибиране [1]. С изучаването на биологичните ефекти на цитокините се появиха и различни методи за оценка на тяхната биологична активност. Така IL-1 се определя чрез оценка на пролиферацията на миши тимоцити in vitro, IL-2 - чрез способността да стимулира пролиферативната активност на лимфобластите, IL-3 - чрез растежа на хемопоетични колонии in vitro, IL-4 - чрез комитогенния ефект, чрез увеличаване на експресията на Ia протеини, чрез индуциране на образуването на IgG1 и IgE и др. [4]. Списъкът с тези методи може да бъде продълженпостоянно се актуализира, тъй като се откриват нови биологични активности на разтворими фактори. Основният им недостатък е нестандартността на методите, невъзможността за тяхното унифициране. По-нататъшното развитие на методите за определяне на биологичната активност на цитокините доведе до създаването на голям брой клетъчни линии, чувствителни към един или друг цитокин, или мултичувствителни линии. Повечето от тези чувствителни към цитокини клетки вече могат да бъдат намерени в списъци с разпространени в търговската мрежа клетъчни линии. Например, за тестване на IL-1a и b се използва клетъчната линия D10S [18], за IL-2 и IL-15, клетъчната линия CTLL-2 [9], за IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF, клетъчната линия TF-1 [13, 16], за IL-6, клетъчната линия B9 [5], за IL-7, 2E8 [11], за TNFa и TNFb, клетъчната линия L929 [8], за IFNg, клетъчната линия WiDr [19] и за IL-18, клетъчната линия KG-1 [14].

Въпреки това, такъв подход към изследването на имуноактивни протеини, заедно с добре известни предимства, като измерване на реалната биологична активност на зрели и активни протеини, висока възпроизводимост при стандартизирани условия, има своите недостатъци. Те включват, на първо място, чувствителността на клетъчните линии не към един цитокин, а към няколко свързани цитокини, чиито биологични ефекти се припокриват. Освен това не може да се изключи възможността за индуциране на производството на други цитокини от клетки-мишени, което може да наруши тестовия параметър (като правило това са пролиферация, цитотоксичност, хемотаксис). Все още не знаем всички цитокини и не всичките им ефекти, така че оценяваме не самия цитокин, а

обща специфична биологична активност. По този начин оценката на биологичната активност като обща активност на различни медиатори (недостатъчнаспецифичност) е един от недостатъците на този метод. Освен това, използвайки чувствителни към цитокини линии, не е възможно да се открият неактивирани молекули и свързани протеини. Това означава, че такива методи не отразяват реалното производство на редица цитокини. Друг важен недостатък на използването на клетъчни линии е необходимостта от лаборатория за клетъчни култури. В допълнение, всички процедури за отглеждане на клетки и инкубирането им с изследваните протеини и среда изискват много време. Трябва също да се отбележи, че дългосрочната употреба на клетъчни линии изисква подновяване или повторно сертифициране, тъй като в резултат на култивирането те могат да мутират и да бъдат модифицирани, което може да доведе до промяна в тяхната чувствителност към медиатори и намаляване на точността на определяне на биологичната активност. Въпреки това, този метод е идеален за тестване на специфичната биологична активност на рекомбинантни медиатори.

Количествено определяне на цитокини с помощта на антитела

Цитокините, произведени от имунокомпетентни и други видове клетки, се освобождават в междуклетъчното пространство за паракринни и автокринни сигнални взаимодействия. Чрез концентрацията на тези протеини в кръвния серум или в кондиционирана среда може да се прецени естеството на патологичния процес и излишъкът или дефицитът на определени клетъчни функции при пациента.

Методите за определяне на цитокини с помощта на специфични антитела в момента са най-разпространените системи за откриване на тези протеини. Тези методи преминаха през цяла поредица от модификации, използвайки различни етикети (радиоизотопни, флуоресцентни, електрохемилуминесцентни, ензимни и др.). Ако радиоизотопните методи имат редица недостатъци, свързани с използването на радиоактивен етикет и ограничено времевъзможността за използване на белязани реагенти (полуживот), тогава ензимно-свързаните имуносорбентни анализи са намерили най-широко разпространение. Те се основават на визуализация на неразтворими продукти от ензимна реакция, които абсорбират светлина с известна дължина на вълната в количества, еквивалентни на концентрацията на аналита. За свързване на субстанциите за измерване се използват антитела, отложени върху твърда полимерна основа, а за визуализация се използват антитела, конюгирани с ензими, обикновено алкална фосфатаза или пероксидаза от хрян [2, 3].

Предимствата на метода са очевидни: това е висока точност на определяне при стандартизирани условия за съхранение на реактиви и извършване на процедури, количествен анализ и възпроизводимост. Недостатъците включват ограничения диапазон на определяните концентрации, в резултат на което всички концентрации, превишаващи определен праг, се считат за равни на него. Трябва да се отбележи, че времето, необходимо за изпълнение на метода, варира в зависимост от препоръките на производителя. При всички случаи обаче говорим за няколко часа, необходими за инкубиране и промиване на реагентите. Освен това се определят латентни и свързани форми на цитокини, които в концентрацията си могат значително да надвишават свободните форми, главно отговорни за биологичната активност на медиатора. Поради това е желателно този метод да се използва заедно с методи за оценка на биологичната активност на медиатора.

Друга модификация на метода за имуноанализ, намерила широко приложение, е електрохемилуминесцентният метод (ECL) за определяне на протеини с антитела, маркирани с рутений и биотин. Този метод има следните предимства в сравнение с радиоизотопните и ензимните имуноанализи: лекота на прилагане, кратко време за изпълнение на техниката, липса на процедури за измиване, малък обем на пробата,голям диапазон на определени концентрации на цитокини в серума и в кондиционирана среда, висока чувствителност на метода и неговата възпроизводимост [17, 7, 21]. Разглежданият метод е приемлив за използване както в научните изследвания, така и в клиниката.

Следният метод за оценка на цитокини в биологична среда се основава на технологията на поточна флуорометрия. Позволява ви едновременно да оцените до сто протеина в проба. Понастоящем са създадени търговски комплекти за определяне на до 17 цитокини [12]. Предимствата на този метод обаче определят и неговите недостатъци. Първо, това е трудоемкостта на избора на оптимални условия за определяне на няколко протеина, и второ, производството на цитокини е каскадно с пикове на производство в различно време. Следователно определянето на голям брой протеини едновременно не винаги е информативно.

Общото изискване на методите за имуноанализ, използващи т.нар. "сандвич" е внимателен подбор на двойка антитела, което ви позволява да определите свободната или свързаната форма на анализирания протеин, което налага ограничения на този метод и което винаги трябва да се взема предвид при интерпретирането на получените данни. Тези методи определят общото производство на цитокини от различни клетки, докато в същото време антиген-специфичното производство на цитокини от имунокомпетентни клетки може да се прецени само условно.

В момента е разработена системата ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), която до голяма степен елиминира тези недостатъци. Методът позволява полуколичествена оценка на производството на цитокини на ниво отделни клетки [6]. Високата разделителна способност на този метод дава възможност да се оцени антиген-стимулираното производство на цитокини, което е много важно за оценка на специфичен имунен отговор.

Следваща, широкаизползван за научни цели, методът е вътреклетъчно определяне на цитокини чрез поточна цитометрия [20]. Предимствата му са очевидни. Можем фенотипно да характеризираме популация от цитокин-продуциращи клетки и/или да определим спектъра на цитокините, произведени от отделни клетки, и е възможно относително да характеризираме това производство. Описаният метод обаче е доста сложен и изисква скъпо оборудване.

Следващата серия от методи, които се използват предимно за научни цели, са имунохистохимичните методи, използващи белязани моноклонални антитела. Предимствата са очевидни - определяне на производството на цитокини директно в тъканите (in situ), където протичат различни имунологични реакции. Разглежданите методи обаче са много трудоемки и не дават точни количествени данни.

1. С.В. Сенников, А.Н. Силков (Цитокини и възпаление. 2005. Том 4, № 1. С. 22-27.)