Основните разпоредби на програмата "човешки геном"
Когато беше създадена Програмата за човешкия геном, бяха идентифицирани три основни цели на тази програма: създаване на точна генетична карта, създаване на физическа карта на човешкия геном и секвениране (дефиниране) на целия човешки геном.
Създаване на генетична карта на генома
Точна генетична карта може да бъде създадена, ако са изпълнени две условия: в генома са открити голям брой полиморфни (разнообразни) генетични маркери и наличието на достатъчен брой семейства, за да се анализира връзката между тези маркери и да се установи тяхната относителна позиция. Проблемът с генетичните маркери беше разрешен след откриването на различни видове ДНК полиморфизми. В реда на въвеждането им в генетичния анализ първо беше открит полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент (накратко RFLP), последван от полиморфизъм с променливо тандемно повторение (VNTR полиморфизъм). Всеки от тези видове има своите предимства и недостатъци, но заедно те правят възможно маркирането на човешкия геном с много висока плътност.
Дори първите 4 вида полиморфизми направиха възможно създаването на генетична картина на човешкия геном. Колекцията или банката от клетъчни линии, получени от всички членове на няколкостотин семейства, които включват най-малко три поколения, направи възможно установяването на относителната позиция на маркерите. Тази банка от клетъчни линии е създадена във Франция за изследване на полиморфизмите в системата HLA и е много полезна за генетично картографиране на човешкия геном. След като 10-15 полиморфни маркера бяха картографирани и позиционирани във всяка хромозома, беше извършена работа с последващи маркери, като се използва материал, получен от членове на тези семейства.
Създаване на физическа карта на генома
За да се създаде физическа карта на генома, клонираните фрагментичовешкият геном също трябваше да бъде етикетиран. Това е направено с помощта на къси последователности (участъци от ДНК с вече дефинирана последователност), така наречените STS, чиято хромозомна локализация е точно известна. STS се идентифицират лесно с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR). Над 50 000 получени STS. разпръснати из целия геном и по време на физическо картографиране, когато се установи относителната позиция на ДНК фрагменти от геномни библиотеки, тези STS се използват като маркери на припокриващи се ДНК сегменти.
Идентификация на човешкия геном
Понятието „чернова“ се отнася основно до факта, че дефинирането на генома е в ход. В това отношение, в настоящия момент на изследване, не е възможно да се подредят и ориентират много малки секвенирани последователности. Непълнотата на последователността, разбира се, все още създава проблеми при идентифицирането на гени за наследствени заболявания, уникални гени и други генетични структури.
Трябва да се отбележи, че през последната четвърт на ХХ век. геномите на 599 вируса и други, както микроорганизми, така и макроорганизми (животни), бяха секвенирани. Опитът, натрупан в резултат на тази работа, беше напълно използван при секвенирането на човешкия геном.
Стратегията за изучаване на човешкия геном в публичен проект включваше получаване на генетична и физическа карта на човешкия геном, след което въвеждане в тези карти на резултатите от секвенирането на отделни клонове на геномна ДНК (стратегия за секвениране клон по клон). Физическата карта на човешкия геном има клонална основа, която е разработена от учения Олсън през 1981 г. Подходът е следният. Геномът е нарязан на сегменти с помощта на частично смилане от ензими - специфични ендонуклеази. Тези големи сегменти от ДНК бяха поставени визкуствени бактериални хромозоми (BAC) и се инжектират в бактерии, където се копират с всяко делене на бактерията. В резултат на това се образуват клонове на идентични ДНК молекули. Трябва да има приблизително 20 000 такива клонинга, обхващащи човешкия геном.
В допълнение, предварително разработени STS карти бяха използвани за установяване на реда на клонингите. Резултатът е физическа карта на генома. Индивидуалните BAC клонове бяха нарязани на фрагменти и клонирани. Изследвани са субклоновете, получени чрез клониране на фрагментите. Всеки път се определя голям брой идентични субклонове, за да се гарантира, че всеки фрагмент от оригиналния BAC клонинг е анализиран няколко пъти и не са допуснати грешки. Последователностите на отделните фрагменти бяха комбинирани, за да се получи нуклеотидната последователност във всеки оригинален BAC клонинг. И накрая, секвенирането на целия геном беше сглобено чрез свързване на последователности от набора BAC, обхващащи целия геном. Създадената по този начин карта на последователността на човешкия геном има повече от 1000 пропуска. Това може да се дължи на редица причини, по-специално на факта, че оригиналните BAC клонинги не припокриват целия геном и припокриването между клонингите е пропуснато поради наличието на големи повторения в генома. Картата на последователностите, създадена в резултат на проекта, включва последователности, съдържащи средно няколко милиона базови двойки по дължина. Сегменти с тази дължина са достатъчни за наслагване на карта, базирана на клонинги, върху други карти с по-ниска резолюция. Позицията върху генетичната карта на секвенираните последователности също беше определена спрямо картирания STS.
Като цяло, около 90% от еухроматичните региони на генома са секвенирани и сглобени с помощта на компютърни програми в разширени региони.
Въпреки непълнотата на последователността, редицас негова помощ резултатите вече представляват несъмнен интерес. Това се отнася преди всичко за задълбочаването на представите за организацията на човешкия геном.