PAAG протеинова електрофореза, Практическа молекулярна биология

У дома. Новини. Относно проекта. Наръчник. Рестрикционни ензими. Методи. Решения. Изчисляване. Отзиви. Обучение. Връзки. Сайт за изтегляне. Образователни ресурси.

Избор на % разтворим гел.

Подготовка на апарата за форезис.

  • измийте камерите с препарат, изплакнете добре;
  • измийте стъклото с препарат (ако е много мръсно или от съмнителен източник - хром); ако искате гелът да се отстранява лесно от чашите - силиконирайте (1 път е достатъчен за

    • 10 писти); изчислете обема на гела:

    10', по време на дегазиране използвайте устройството за фореза:

    * сглобете уреда за форезис, маркирайте нивото на концентриращия гел с флумастер (дължината на зъбците на гребена + 1см); *

    Изсипете 5-10 ml разтопена 1,5% агароза (в GTB-буфер) върху равна хоризонтална повърхност. Незабавно инсталирайте инструмента с предметни стъкла (агарозата ще се издигне между предметните стъкла с

    2-10 мм). * "разпръснете" външните ръбове на разделителите с агароза;

  • изсипете концентриращия гел до марката;
  • слой бутанол отгоре (

    • 3-10 мм);

  • обезгазяване на концентриращия гел по време на полимеризация;
  • след завършване на полимеризацията изсмучете бутанол, изплакнете получения джоб 2-3 пъти с дестилирана вода, изсмучете остатъците с удължен тип;
  • поставете (не напълно) гребена между стъклата;
  • изсипете концентриращия гел, поставете гребена напълно;
  • след полимеризация, монтирайте горната камера в долната, напълнете буфера, издърпайте гребена;
  • незабавно изплакнете ямките със спринцовка, коригирайте извитите прегради между джобовете (или с плосък тип, или с игла на спринцовка);

  • материал + буфер за приложение, смесване, кипене 5' преди фореза;
  • изплакнете ямките преди нанасянеспринцовка;
  • задвижване под напрежение (за мини и миди камери)

    • 10V/cm в концентриращ гел,

    180V с резолюция.

  • Разтварящият и концентриращият гел имат различни буфери, така че напълненият гел не може да се съхранява дълго време. В екстремни случаи може да се остави ВКЛЮЧЕН при +4 o C, без да се маха гребена и да се увиват горната и долната част на SaranWrap, за да не изсъхне.
  • Бромфеноловото синьо се доставя с предна част за форезис. Под него няма протеини.
  • Опасно е да се прилага протеин с висока концентрация на сол за форезата: 1) K + (и някои други катиони) могат да се утаят с протеин и SDS, 2) високата сол не позволява на протеините да навлязат в гела. Въпреки това, често концентриращият гел е в състояние да осигури добра картина, дори ако клетката се е утаила първоначално.
  • В случай на бактериална култура със средна плътност на ямка от PAAG 0,75x2,5 mm2, трябва да вземете материал от

    • 15 µl бактериална култура.

    Напълно възможно е да се използват междинни концентрации.

    Кислородът е инхибитор на полимеризацията. Без дегазиране гелът, разбира се, ще полимеризира, но за по-дълго време (в този случай си струва да увеличите количеството на PSA и TEMED с коефициент един и половина).

    Лесен за изливане от остатъчен гел разтвор

    0,5-1,0 ml в епруветка от 1,7 ml и го използвайте като индикатор за полимеризация.

    Може да се попива със сгънат филтър.

  • Поставянето на гребена след изливане на гела е ненужна суета по време на втвърдяване и ще изстиска значително количество гел в камерата.