Принципи и методи на генното инженерство

Клетъчни и генетични основи на биотехнологиите

NEIFAKH Александър Александрович- доктор на биологичните науки, главен научен сътрудник на Института по биология на развитието на Академията на науките на СССР. Автор на откритието за периодичността на морфогенетичната функция на ядрата (1962) и на повече от 150 научни труда и 5 книги по молекулярна биология на развитието, публикувани у нас и в чужбина.

Рецензент Н.Г. Хрушчов, член-кореспондент на Академията на науките на СССР.

Принципи и методи на генното инженерство

Задачата на генното инженерство е изолирането на отделни гени, тяхното молекулярно клониране и създаването на рекомбинантна ДНК - изкуствена комбинация от гени и различни промотори. След това те обикновено се опитват да открият експресията на тези гени, т.е. транскрипция и транслация. Помислете първо за първия етап от тази работа - изолирането и клонирането на гени. Инструментите в тази работа, както вече споменахме, са специални ензими, които се получават от различни източници - бактерии, клетки на бозайници и птици, отгледани в култура и заразени с различни вируси и т.н. Основно се използват три вида ензими: рестрикционни ензими, лигаза и обратна транскриптаза.

Рестрикционните ензимиса вид дезоксирибонуклеази, ензими, които нарязват ДНК на къси или дълги сегменти или дори на отделни нуклеотиди. Особеността на рестриктазите е, че те не разрязват ДНК на което и да е място, а само между определени нуклеотиди в участък с нуклеотидна последователност, строго характерна за всеки рестрикционен ензим. Обикновено това са 4-6 базови двойки, но различните рестриктази се различават точно по реда на нуклеотидите в мястото на срязване. Например, рестрикционният ензим EcoR1 разцепва ДНК в сайта HAATTC, а рестрикционният ензим BamH1 разцепва в сайта GGATC. Вече са известни повече от сто различни последователности,които се "разпознават" от различни рестрнкази. При произволно разпределение на нуклеотидите по дължината на ДНК вероятността да се намери последователност от четири конкретни нуклеотида е 1/256, а от шест - 1/4096. Следователно рестрикционните ензими нарязват ДНК на парчета, състоящи се от няколкостотин или хиляди базови двойки.
Лигаза- ензим, който свързва свободните краища на ДНК заедно. Този ензим в нормалните клетки участва в синтеза на ДНК и в процесите на нейното възстановяване, т.е. възстановяване на нормалната структура на ДНК след нейното частично увреждане.
Обратна транскриптаза- ензим, подобен на ДНК полимераза, но синтезиращ ДНК не върху ДНК, а върху РНК. В сравнение с РНК полимеразата, този ензим работи сякаш в обратна посока, тоест не от ДНК към РНК, а от РНК към ДНК. Дали има обратна транскриптаза в нормалните клетки и дали ДНК се синтезира в РНК в тях е спорен въпрос и все още не е окончателно разрешен. Но този ензим се появява в еукариотните клетки, когато те са заразени с вируси, съдържащи РНК и размножаващи се чрез ДНК. Геномът на тези вируси кодира обратна транскриптаза, която образува вирусна ДНК матрица, върху която след това се синтезират много вирусни РНК молекули.

Първата стъпка в клонирането на ген е да се получи "библиотека" от гени и да се намери необходимият ни ген в нейния състав, например човешки ген, който кодира един от глобините - протеини, които образуват хемоглобина в еритроцитите. Получаването на "библиотека" от гени започва с разрязването на изследваната ДНК (в нашия пример човешка ДНК) на множество фрагменти. Броят на такива фрагменти зависи от избрания рестрикционен ензим. За да се получат фрагменти, съдържащи отделни гени, е необходимо ДНК да се разреже на няколко десетки или дори стотици хиляди фрагменти. За разделяне на генитеедин от друг се използват плазмиди, в които ДНК фрагменти се въвеждат в други клетки, обикновено бактериални. Такъв плазмид-носител се нарича вектор.

Като вектор обикновено се избира плазмид, който съдържа ген за резистентност към антибиотик, например ампицилин, към който Е. coli е много чувствителен. Този плазмид се нарязва с рестрикционен ензим на едно специфично място, смесва се със смес от човешки ДНК фрагменти и се добавя лигаза, която повторно омрежва отрязаните краища. В много случаи лигазата просто завърта плазмида обратно в кръг, но доста често тя лигира свободните краища на ДНК фрагментите към свободните краища на плазмидната ДНК. В резултат на това възникват множество кръгли плазмиди, в които са вмъкнати различни фрагменти от човешка ДНК. Някъде сред тях ще бъде генът, от който се нуждаем за един от глобините.

В Съединените щати са създадени три хормона чрез генно инженерство, които могат да се използват като средство за увеличаване на репродуктивната способност на коне и свине. Получени са конски фоликулостимулиращ и лутеинизиращ хормони и свински фоликулостимулиращ хормон.

(Chemical Week, 1986, V. 138, No. 7. - Биотехнология, No. 5, 1986).

След това тези плазмиди се "инфектират" с E. coli или друг вид клетка. Клетките се засяват върху хранителна среда, така че всяка бактериална клетка да лежи отделно от другите и да може да образува своя собствена колония. Такива колонии не образуват бактерии, които не съдържат плазмида, тъй като към средата се добавя същият антибиотик (ампицилин), срещу който плазмидът защитава. Но в някои бактерии ще има такива плазмиди, в които не е интегриран ДНК фрагмент. Такива колонии също могат да бъдат изключени, тъй като включването на чужди гени намалява резистентността към друг антибиотик.(тетрациклин) и след това отглеждайте само тези чувствителни колонии.

Всяка колония, образувана от една бактериална клетка, ще съдържа само един вариант на плазмидите с един фрагмент от човешка ДНК - този, който се е оказал в плазмида, попаднал в оригиналната бактерия. Но тъй като има много колонии (обикновено десетки хиляди), по принцип всички фрагменти на ДНК, т.е. в нашия случай всички човешки гени, трябва да бъдат представени в тях отделно. Разбира се, такава "библиотека" се получава идеално. Всъщност много плазмиди ще съдържат само фрагменти от области, които не съдържат гени, някои ще съдържат само част от ген или два гена (това зависи от избора на рестриктаза). Но има основание да се очаква, че една или няколко колонии ще съдържат точно този плазмпду, в който е попаднал генът, от който се нуждаем като цяло.

Въпреки че по принцип всички човешки гени могат да бъдат получени от такава "библиотека", за това е необходимо да можем да ги изолираме, тоест всеки път да разграничаваме колонията, от която се нуждаем, от всички останали. Има различни начини за откриване. Помислете за най-простия, подходящ само за глобинови гени. Не е много трудно да се получат млади кръвни клетки, бъдещи еритроцити, в които синтезът на глобин е много интензивен, а глобиновата иРНК съставлява повече от 80% от цялата иРНК. Ако молекулите на тази иРНК се хибридизират с ДНК на бактериите, тя образува хибрид само с колонията, която съдържа ДНК фрагмента, съдържащ глобиновия ген. Много по-често това става по различен начин, чрез радиоактивно белязана ДНК. За да направите това, глобиновата иРНК се поддържа заедно с обратна транскриптаза и радиоактивни нуклеотиди, така че да се синтезира радиоактивна ДНК, която е комплементарно копие на иРНК. Тази ДНК се нарича cDNA. Радиоактивната глобинова кДНК се хибридизира с разрушенабактерии. В резултат на това много малкото колонии, в които ще настъпи хибридизация, се откриват лесно от тяхната радиоактивност. Това е колонията, от която се нуждаем, съдържаща човешкия глобинов ген.

След като бъде открита колония от бактерии, съдържаща плазмид с гена, от който се нуждаем, тя може да бъде клонирана неограничено време. За целта бактериалният щам се размножава, от тях се изолира плазмидна ДНК, а от нея (отново с помощта на рестриктази) – вграденият ген. Първата и все още не най-трудна част от работата по това може да се счита за завършена. Останалата "библиотека" може да се използва за изолиране на други гени от нея. След това клонираният ген може да се използва за различни цели, като например подробното му изучаване. В много изследвания гените се подлагат на секвениране, т.е. изучаване на тяхната нуклеотидна последователност. Такива данни са много полезни за сравнение с последователността от нуклеотиди в подобни гени на други животни или с други гени, за да се открие техният общ еволюционен произход.

Сега за нас е по-важно да разгледаме нещо друго - опитите да накараме клонирания ген да работи в бактериална клетка. Работата на гена, наречена експресия, се състои от транскрипция и транслация. В най-простия случай ДНК фрагмент, съдържащ ген, включва и неговата регулаторна част. Изглежда, че сега можем да очакваме, че транскрипцията на такъв ген ще бъде възможна. За еукариотните гени обаче тази възможност е малко вероятна, тъй като бактериите нямат тези регулаторни протеини, които са способни да включват еукариотни гени. Следователно е необходимо да се премахне цялата регулаторна област на еукариотния ген и да се замени с регулаторната област на бактериалния ген или е по-лесно да се изреже бактериалната ДНК на границата на гена и промотора и да се вмъкне еукариотният ген там. Всички тези манипулации се извършват и с помощта на рестриктаза,в състояние да среже ДНК на правилното място и да лигазира, зашивайки заедно срязаните места. Така се създава кръгова ДНК, в която съседстват участъци от ДНК с различен произход - плазмидна и човешка. Такава ДНК се нарича рекомбинантна.

Конструирането на добър промотор осигурява само първата част от генната експресия - неговата транскрипция, т.е. синтеза на РНК. Но също толкова важно е да се осигури втората част от експресията - транслацията, т.е. протеиновият синтез. Тук разликата между бактериалните и еукариотните рибозоми може да бъде пречка. Факт е, че не цялата молекула иРНК кодира последователността от аминокиселини в протеина. Първоначалният му къс участък служи за прикрепване към рибозомата, като за целта има специална последователност от няколко нуклеотида. Установено е, че тази последователност е различна при еукариотите и прокариотите. Следователно трябва да поставим еукариотния ген, който изучаваме, след частта от бактериалния ген, която е важна за началото на транслацията. И накрая, има още една важна пречка - неспособността на бактериите да се снаждат, т.е. да изрязват от новосинтезираната еукариотна РНК тези некодиращи области, които са били прочетени от интрони. Един от начините за преодоляване на това препятствие е да се използва не истинският ген, а неговата кДНК. Както вече споменахме, ако вземем сплайсирана иРНК, т.е. вече без интрони и се подлага на действието на обратната транскриптаза, тогава се синтезира cDNA (копие на еукариотния ген, но лишено от интрони). Експресията на такъв ген не изисква снаждане.

Предлага се също да се използват еукариотни клетки, като дрожди, вместо бактерии за експресия. Наистина е възможно да се постави клониран ген в дрожден плазмид и да се въведе в тези протозойни, но все пак еукариотни клетки, които по-специално имат ензими за снаждане. въпреки товадосега опити от този вид са неуспешни - дрождите наистина имат сплайсинг, но той очевидно се случва по различен начин, отколкото при висшите еукариоти. Следователно РНК, прочетена от гени на бозайници, не претърпява правилно снаждане в дрождите.

Всички тези експерименти са по-лесни за провеждане, когато има начин да се изберат бактериални клетки, в които вмъкнатият ген се експресира от тези, в които такава експресия по някаква причина не се случва. Пример за такова изследване са експерименти, в които е използван човешки ензим, дехидрофолат редуктаза. Този ензим е от съществено значение за нормалния синтез на нуклеинови киселини. Има обаче инхибитор метотрексат, който потиска този ензим. Оказа се, че ако вземете cDNA с иРНК на този ензим и го въведете с плазмид в бактериална клетка и добавите малко инхибитор към средата, тогава само тези клетки ще растат и ще се делят, където синтезът на ензима е толкова активен, че малки дози от инхибитора не могат да го потиснат. В резултат на това бяха избрани само тези бактериални клетки, където експресията на човешкия ген беше особено интензивна.

Трудностите, свързани с експресията на еукариотни гени в бактериални клетки, принуждават изследователите да търсят други начини, сред които използването на клетки от бозайници в тъканна култура. Разбира се, много по-трудно е да се работи с тях и все още е необходимо първоначално да се клонират гените в E. coli с помощта на бактериални вектори - плазмиди. Но тогава е възможно да се въведе клонираният ген в клетки на бозайник, например чрез микроинжектиране. В друг вариант клонираните гени също се въвеждат в яйцеклетки на бозайници чрез микроинжектиране и от тях се отглеждат цели животни, в чийто геном се вмъкват (интегрират) клонираните гени. Досега това бяха само мишки, но вече зайци, прасета, овце, вгенома, в който са интегрирани чужди гени. Такива животни се наричат "трансгенни".

По-долу ще опишем онези експерименти, при които беше възможно успешно да се интегрира генът на хормона на растежа на плъх в генома на мишката и да се получи синтез на големи количества от хормона, което значително увеличи растежа на мишките. Експериментаторите успяха да намерят няколко плазмида за растения, които могат да проникнат от клетки на специфични бактерии в растителни клетки. В допълнение към плазмидите се използват и други генни носители. Понякога те са еукариотни вируси или бактериални фаги. Има опити да се използва за тази цел ДНК от митохондрии или хлоропласти - клетъчни частици, отговорни за енергията и фотосинтезата и притежаващи собствена кръгова ДНК.

Тук разгледахме само основните принципи на методите на генното инженерство. Тези методи имат много варианти, които се разработват в десетки и стотици лаборатории в много страни по света и у нас. Целта на тези изследвания е да се изследва структурата на гените и механизмите на регулиране на тяхната експресия. Но много от техниките на генното инженерство са намерили своето място в практически приложения за разработването на нови биотехнологии.

Източник:Neifakh A.A. Клетъчни и генетични основи на биотехнологията. - М.: Знание (серия "Биология"), 1987.