Техника на приготвяне
Фиксираният препарат се поставя върху успоредни стъклени летви, които лежат над кюветата. 1% воден разтвор на фуксин или метиленово синьо се нанася върху намазката за 1-2 минути. Уверете се, че разтворът на багрилото не изсъхва по време на оцветяването. След завършване на оцветяването препаратът се измива с вода, докато течащата вода стане безцветна. След това препаратът се изсушава, попива се с филтърна хартия, върху оцветената суха намазка се нанася капка имерсионно масло и се микроскопира с имерсионна система.
1. Запознаване с правилата за работа в микробиологична лаборатория.
2. Съвременни методи за работа с имерсионен обектив.
3. Устройството на фазово-контрастни, електронни и луминесцентни микроскопи.
4. Микроскопия в тъмно поле
1. Всеки ученик микроскопира със суха и имерсионна леща готови оцветени петна от дрожди, антракоиди, стафилококи, стрептококи.
2. Всеки ученик изготвя 3 натривки от препарата от бактериални култури: сарцин, стафилокок, антракоид, ешерихия коли, вибрион; оцветени с Pfeiffer magenta, метиленово синьо; Микроскопи с потапяща леща; рисува изображение.
3. В хода на работа е необходимо да се овладеят и запишат в тетрадка: а) методи за дезинфекция на отпадъчни материали и обекти на околната среда, замърсени с микроби; б) методи за антисептично третиране на ръце, замърсени с тестовия материал, култури от патогенни микроби.
1. Какви задачи изпълнява медицинската микробиология?
2. Каква е структурата и оборудването на микробиологичната лаборатория?
3. Защо е необходимо да се спазват правилата за работа в микробиологична лаборатория? Какво са те?
4. Как да определимувеличение на микроскопа?
5. Каква е разделителната способност на микроскопа и от какви фактори зависи?
6. Какви са предимствата на имерсионния обектив?
7. Посочете правилата за работа с потапящ обектив.
8. Кои са двете основни системи на електронния микроскоп?
9. Какви са основните разлики между електронния микроскоп и светлинния микроскоп?
10. Как се подготвят пробите за електронна микроскопия?
11. Основни принципи на работа на фазово-контрастен микроскоп.
12. Основни принципи на работа на луминисцентен микроскоп.
13. Принципът на микроскопията в тъмно поле.
14. Какво е в основата на избора на метода за микроскопско изследване на микропрепаратите?
15. Кои са основните форми на сферичните, пръчковидни и извити бактерии.
16. Какви са етапите на процеса на подготовка на цитонамазката?
17. За какво е и как се извършва фиксацията на бактериален микропрепарат?
18. Какви са тинкториалните свойства на бактериите?
19. Назовете основните бои, използвани за оцветяване на микропрепарати
20. Защо да изучаваме тинкториалните свойства на бактериите?
21. Какво е просто оцветяване?
Тема:
•Структура на бактериална клетка, сложни методи за оцветяване (метод по Грам), подвижност на бактериите.
План на урока:
1. Устройството на бактериалната клетка.
2. Сложни методи за боядисване. Оцветяване по Грам.
3. Изследването на микроорганизмите в живо състояние, мобилността на бактериите.
Според класификацията на Берги всички микроорганизми се делят на три царства: I – Еукариоти, II – Прокариоти, III – царство – Vira. Бактериите са прокариоти. Прокариотните клетки имат по-проста структура от еукариотните клетки. Имат клетъчна стенацитоплазмена мембрана, цитоплазма, рибозоми, мезозоми и ядрена субстанция (нуклеоид), състояща се от ДНК, свързана с малко количество РНК. Ядреното вещество е разположено свободно в цитоплазмата, тъй като няма ядрена обвивка. Тези компоненти са задължителни. В допълнение, една бактериална клетка може да има незадължителни (допълнителни) компоненти като капсула, спори, камшичета, включвания (напр. волютинови зърна). Те се откриват чрез сложни методи за оцветяване или специални методи за изследване (например микроскопия на препарати, приготвени от живи микроорганизми), които могат да бъдат от голямо значение за идентифицирането на бактериите.
Цел на дейността:
1. Запознайте се със структурните (диференциални) характеристики на прокариотите и овладейте някои методи за тяхното изследване (оцветяване по Грам и изследване на подвижността).
Целеви задачи:
Знай:
1 Постоянни и непостоянни структури на бактериална клетка, техните функции.
2. Разлики в структурата на Грам-положителните и Грам-отрицателните бактерии.
3. Методи за изследване на структурните характеристики на микроорганизмите в нативно и оцветено състояние:
а) техниката на приготвяне и характеристиките на микроскопията на нативните препарати;
б) сложен метод на оцветяване по Грам.
Знай:
1. Оцветете предметното стъкло по метода на Грам.
2. Пригответе и микроскопирайте препарати от живи бактерии
1. При сложни методи на оцветяване един и същ препарат се влияе от няколко багрила, едното от които се нарича основно, останалите са допълнителни. Освен багрила се използват различни избелващи средства: алкохоли, киселини, ацетон и др., които играят ролята на диференциатори. Със сложни техники за оцветяванеразкриват цитологични характеристики на клетките на микроорганизмите (клетъчни структури, резервни вещества, включвания и др.)
Оцветяването по Грам е най-универсалният от комплексните методи за оцветяване. Оцветяването е в основата на бактериалната диференциация и отразява способността на клетките да възприемат и задържат оцветяващия комплекс от тинтява виолет и йод вътре в клетката или да го загубят след третиране с алкохол. В характеристиките на микроба на всеки вид е необходимо да се посочи отношението към оцветяването по Грам. Всички бактерии във връзка с този метод на оцветяване са разделени на две групи: грам-положителни: (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina и др.) И грам-отрицателни (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia и др.) форми.
Съотношението на бактериите към оцветяването по Грам се определя от тяхната способност да задържат комплекса от генциан-виолет и йод, образуван по време на процеса на оцветяване. При грам-положителните бактерии основното вещество на клетъчната стена (до 90%) са мукопептиди - муреин (пептидогликан) в комбинация с тейхоева киселина и магнезиев рибонуклеат. В грам-отрицателните бактерии еднослойният муреин се намира дълбоко в клетката, има много повече протеини и липиди, които заедно с полизахаридите образуват повърхностни слоеве под формата на мозайка, тяхната цитоплазма съдържа РНК и ДНК в съотношение съответно 8:1 и 1:1. В допълнение, пропускливостта на клетъчната стена в грам-положителните бактерии е по-малка, отколкото в грам-отрицателните. Това се обяснява и с по-малкия диаметър на порите при грам-положителните бактерии, което допринася за задържането на комплекса, образуван при третиране на бактериите с етилов алкохол.
Техника на оцветяване по Грам (модификация на Синев)
1. Лента филтърна хартия, боядисанакарболова тинтява виолетова и се навлажнява с няколко капки вода.
2. След една и половина до две минути хартиената лента се отстранява и разтворът на Лугол се нанася върху препарата за 1 минута.
3. Изцедете разтвора на Лугол и без да изплаквате с вода, действайте със спирт за няколко секунди, докато боята спре да се отделя от петното.
4. Измийте добре препарата с вода.
5. Завършете с разреден фуксин за 1-2 минути.
6. Изплакнете с вода, подсушете с филтърна хартия и прегледайте предметното стъкло с потапяща система.
Грам-положителните микроби са лилави, Грам-отрицателните микроби са червени.
2. В микробиологичната практика за изследване на морфологията на бактериите понякога се използват неоцветени препарати (нативни), приготвени от естествени проби или от колонии от отглеждани микроорганизми. Най-често се приготвят нативни препарати за изследване на живи неоцветени бактерии с цел установяване на тяхната подвижност. Постъпателното движение на бактерии чрез флагели може да се наблюдава във влажни препарати, като се използва микроскоп със светло поле с понижен кондензатор, но най-добре се изследва в тъмно поле или с помощта на фазово-контрастен микроскоп. За in vivo изследване на бактерии често се използват методите на "висяща капка", "натрошена капка", микрокамери с плътна среда.
Препаратът „натрошена капка“ се приготвя върху предметно стъкло, върху което се нанася капка вода. Малко количество от изследваната култура се въвежда в него със стерилна бактериологична примка, емулгирана и покрита с покривно стъкло. Излишната течност се отстранява с филтърна хартия. Ако се изследват бульонни култури, тогава капка от него се нанася директно върху предметно стъкло. Препаратът се микроскопира с обективи x40 или x90.
Окачване на наркотициdrop " се използва за дългосрочно наблюдение на растежа и развитието на микроорганизми. Малка капка бульонна култура от микроорганизми се поставя с помощта на бактериологична примка върху стерилно покривно стъкло. Стъклото се обръща с главата надолу и се поставя върху предметно стъкло с дупка. Капката трябва да виси свободно в дупката, без да засяга нейните ръбове и дъно. За да създадете мокра камера и да предпазите краищата на дупката от изсъхване, намажете с вазелин. Микроскопират се по същия начин, както препарата „натрошена капка”.
Микрокамери с твърда среда се приготвят върху стерилни предметни стъкла с тънък слой хранителен агар. Бактериите се прилагат с помощта на пипета на Пастьор. Отрежете агара около избраната област, поставете покривно стъкло отгоре. За да се предотврати изсъхването, такива препарати или се инкубират в затворена камера, или празнините между стъклата се запечатват чрез пълнене с парафин или восък.
За да се провери дали камшичетата наистина са присъщи на тези микроорганизми, както и да се определи тяхното местоположение (полярно, перитрихиално, странично), са необходими методи, използващи оцветяване. Предложени са няколко метода за оцветяване на камшичета, общата стъпка за които е ецване на препарата (обикновено с разтвори на танин, KA1(SO4)2, HgCl2) и последващо оцветяване (често с карболов разтвор на фуксин). В резултат на това багрилото се отлага върху флагелите, поради което едновременно се постига както увеличаване на тяхната дебелина, така и намаляване на прозрачността.
Бактериалната подвижност може да бъде открита чрез използване натехниката за инокулиране на колона с агар. В този случай бактериалната култура се инокулира с колонно инжектиране на 0,3% културална среда в епруветка. Епруветките се поставят в термостат за инкубация. Резултатите се отчитат след 24 - 48 часа. Подвиженбактериите растат по цялата дебелина на агара, причинявайки дифузно помътняване на средата.
1. Техника на оцветяване по Грам
1. Подгответе препарати от грам-положителни и грам-отрицателни култури (стафилококи, антракоиди, Escherichia coli, vibrio), оцветете по Грам, микроскоп, скица.
2. Пригответе препарат „натрошена капка” от зъбна плака и чиста култура от воден вибрион, микроскопирайте в тъмно поле и нарисувайте резултата.
1. Какви са разликите в анатомията на еукариотите и прокариотите?
2. Какви свойства на бактериите могат да бъдат изследвани в резултат на оцветяване с прости и сложни методи?
3. Какви методи на оцветяване се наричат диференциални? Назовете ги.
4. Какви свойства на бактериите влияят върху способността им да възприемат
5. Какъв метод на оцветяване позволява да се разделят всички бактерии на две алтернативни групи?
6. Каква е структурата на клетъчната стена на грам-положителните и грам-отрицателните бактерии?
7. Обяснете последователността и механизма на оцветяването по Грам. Какъв цвят могат да придобият бактериите и защо?
8. Назовете морфологичните разновидности на грам-положителните и грам-отрицателните бактерии.
9. Какво е значението на камшичетата в биологията на бактериите?
10. Как се определя подвижността на бактериите чрез микроскопския метод?
11. Как се определя подвижността на бактериите чрез метода на културата?
12. Какво е практическото значение на изучаването на подвижността на бактериите?
13. Как се приготвят "висящи" и "натрошени" капки и какви са характеристиките на тяхната микроскопия?
14. Какви са възможностите за местоположението на камшичетата в бактериите?