Вирусни вектори за доставяне на терапевтични гени
Една от ключовите задачи при разработването на "инструменти" за генна терапия е създаването на експресионни генетични конструкции, които осигуряват трансфера на рекомбинантни гени в целевите клетки in vitro и in vivo. Идеалната векторна система в генната терапия не изисква инвазивни методи за доставяне, ограничена е до действие само върху целевите клетки и осигурява експресията на известно количество трансгенни продукти за определен период от време. Вирусите са естествена биологична система за прехвърляне на гени в еукариотни клетки. Доставянето на ген с помощта на вирусни вектори (аденовирус и херпес симплекс вирус) понастоящем остава един от водещите методи за таргетна терапия при заболявания на централната нервна система.
Аденовирусите като вектори за доставяне на рекомбинантни нуклеинови киселини в клетките са сред най-изследваните и безопасни по отношение на неконтролирана диференциация на трансплантирани клетки и онкогенност (Gonzalez et al. 2009, Gray et al. 2011, Gray et al. 2011). Аденовирусните вектори ефективно пренасят гени както в делящи се, така и в неделящи се клетки, не се интегрират в генома, осигуряват високи титри на рекомбинантния вирус и високо ниво на експресия на въведените гени. Доказано е, че локалното доставяне на гена на глиалния невротрофичен фактор (GDNF) в областта на увреждане на гръбначния мозък с помощта на аденовирусен вектор предотвратява ретроградна атрофия на кортикоспиналните моторни неврони и стимулира възстановяването на двигателната функция (Tang et al. 2004). Доставянето на същия рекомбинантен аденовирус в комбинация с L-аргинин при травматично мозъчно увреждане не възстановява функционалния дефицит, нонамалява площта на увреждане (Degeorge et al. 2011).
Адено-асоцииран вирусот див тип има някои предимства за генната терапия. Едно от основните предимства е, че този вирус не причинява заболяване при хората. Адено-асоциираният вирус може да инфектира неделящи се клетки и може да се интегрира в генома на гостоприемника на специфични места на деветнадесетата хромозома. Тази функция прави адено-асоциирания вирус по-предвидим от ретровирусите. Ретровирусите са потенциално опасни като мутагени, тъй като произволно се интегрират в генома на гостоприемника, което може да доведе до появата на ракови тумори.
Адено-асоциираният вирус също има много ниска имуногенност, очевидно ограничена от ниската ефективност на образуването на неутрализиращи антитела, докато последното не е ясно доказано, че е цитотоксично. Описаните характеристики, както и способността за инфектиране на неделящи се клетки, определят предимствата на адено-асоциирания вирус пред аденовирусите за генна терапия (Ruitenberg et al. 2002). Използването на адено-асоцииран вирус също има някои недостатъци. Капацитетът на вирусния геном, наличен за клониране на терапевтични гени, е само около 4800 базови двойки. Следователно този вектор не е подходящ за клониране на големи гени.
Лентивируситесъщо се считат за обещаващи при разработването на методи за генна терапия. Лентивирусите са в състояние да доставят значително количество генетичен материал в клетката гостоприемник и имат способността, уникална сред ретровирусите, да се репликират в неделящи се клетки. Лентивирусите, подобно на аденовирусите, могат да заразят различни клетки. В същото време, поради интегрирането в генома на клетката гостоприемник, те осигуряват дългосрочноекспресия и трансфер на трансгена към дъщерните клетки по време на деленето.
Технологията на вирусна трансдукция е използвана за клетъчно фенотипиране в областта на увреждане на гръбначния мозък, включително тези в глиалната бариера. По този начин, след инжектиране на лентивирусен вектор с гена на зеления флуоресцентен протеин в областта на глиалния белег две седмици след нараняване на гръбначния мозък на плъх, беше установено чрез имунохистохимичен метод с антитела срещу маркери на различни нервни клетки, че белегът е ограничен от натрупването на реактивни астроцити, невронни прогенитори, микроглия и олигодендроцити, както и макрофаги (Hendriks и др. 2007).
С помощта на системата за клониране Gateway бяха получени рекомбинантни аденовируси и лентивируси, експресиращи различни изоформи на васкуларен ендотелен растежен фактор (VEGF121, VEGF165, VEGF189), основен фибробластен растежен фактор FGF2 и глиален невротрофичен фактор gdnf (Cherenkova et al. 2012).
Вирусните вектори имат висока трансфекционна активност, но не се считат за напълно безопасни поради вероятността от инсерционна мутагенеза,изразени възпалителни и имунни отговори, както и токсичност.
Сред другите недостатъци на вирусните вектори са липсата на постоянна експресия (аденовирус), малкият размер на вмъкването на трансгенния конструкт (аденовирус, рекомбинантен адено-асоцииран вирус), краткотрайна експресия на трансгени (херпесвируси), трансдукция само на делящи се клетки (ретровируси), производствените методи са трудоемки и скъпи (Bleiziffer et al. 2007). Алтернатива на генно-клетъчната терапия с помощта на вирусни вектори е използването на невирусни (плазмидни) вектори, при които, въпреки по-ниската активност на трансфекция, горните недостатъци или изобщо не се появяват,или в много по-малка степен. В случай на използване на невирусни вектори, за да се постигне необходимата ефективност на трансфекция, човек трябва да следва нежелания път на увеличаване на количеството на трансгена.