1.5. Методи за изолиране на чисти култури от микроорганизми
1. Метод за механично отделяне на микроорганизми:
а) инокулация на материала върху петриеви панички с шпатула или примка (виж Практикум);
б) инокулация с разпръскване на плака - приготвят се десетократни разреждания на материала в разтопен и охладен до 45°C МРА, след което съдържанието на епруветките се излива в стерилни петриеви панички, агарът се оставя да се втвърди и съдовете се инкубират в термостат;
в) разделяне въз основа на мобилността на микробите. Материалът се посява в капка кондензирана течност на скосения MPA. В този случай подвижните микроби сякаш "мигрират" нагоре по фаската на агара и се намират в горната част на агара. Преминаването на тези колонии 2-3 пъти в кондензираната течност на наклонен агар прави възможно получаването на чиста култура на подвижен микроб (например Proteus);
г) разделяне въз основа на разликите в размера на микроорганизмите. За да направите това, смес от микроорганизми се филтрира през микро- и милипорести филтри. Чистите култури се получават, като правило, във филтрати. Този метод се използва за получаване на чисти култури от вируси и микоплазми.
2. Метод на заразяване на чувствителни лабораторни животни (биологичен):
се основава на селективната чувствителност на животинския организъм към различни видове микроби, изразяваща се в бързата скорост на размножаване на определен вид, когато той навлезе в кръвта и вътрешните органи, откъдето се изолира. В същото време други видове микроби умират под въздействието на защитните фактори на тялото. Така, например, чиста култура от пневмококи се изолира от тялото на бяла мишка, туларемични пръчици от тялото на морско свинче.
3. Методи, базирани на селективната чувствителност на микроорганизмите към външни фактори:
а) температура - спорообразуващите микроби оцеляват, когато сместа от микроби се нагрява, докатонеспорообразуващи - загиват
б) киселини - при обработка на смеси от киселинно-устойчиви и киселинно-устойчиви микроби, последните умират, а киселинно-устойчивите, като правило, остават в чиста култура. Така се изолира причинителят на туберкулозата;
в) антибиотици - при засяване на смес от микроби върху среда с добавка на антибиотик се развиват нечувствителни към него микроби;
г) анаеробни условия - ви позволяват да отделите групата анаеробни микроорганизми от задължителните аероби.
1.6. Определяне на биохимичните свойства на микробите
Този метод включва изследване на ензимното разграждане на различни субстрати (въглехидрати, аминокиселини и протеини, урея, водороден пероксид и др.) с образуването на междинни и крайни
Карбохидрази- ензими, които разграждат въглехидратите. Чрез определяне на карбохидрази, т.нар. захаролитични свойства на микробите. За тази цел се използват следните медии:
а) Хис среда (течна и полутечна с индикатори). Като последния се използва реактив на Андреде, бромтимолово синьо или BP.Ензимната активност на бактериите се съди по промяната на цвета на средата и образуването на газ;
б) диференциално диагностични среди с лактоза (Endo, Levina, Ploskireva и др.);
в) поливъглехидратни среди (като Olkenitsky, Kligler и др.).
Протеази- ензими, които разграждат протеини:
а) изследваната култура може да разцепи субстратни протеини с образуването на пептон, албумоза, аминокиселини. Този процес се дължи на ензими-протеинази и пептидази. За да се идентифицират тези ензими, изследваната култура се инокулира върху редица среди: съсирена суроватка, колона от желатин (втечняване в положителни случаи), млечен агар в петриево блюдо (в положителни случаи около колониите се появяват зони на мътност);
б) разделянеаминокиселините от микроби могат да преминат чрез декарбоксилиране или чрез дезаминиране. В първия случай от една или друга аминокиселина се образуват амини, които се откриват или чрез електрофореза. или чрез алкализиране на средата. Наличието на деаминази в микроба се съди по образуването на амоняк в средата в резултат на процеса на дезаминиране на аминокиселини;
в) разцепването на аминокиселината триптофан под действието на ензима триптофаназа се придружава от образуването на индол. Последният се открива с помощта на лист хартия, навлажнен с оксалова киселина и фиксиран под тапа върху хранителна среда. В положителни случаи хартията става червена;
г) за идентифициране на ензими за разцепване на съдържащи сяра аминокиселини (цистин, цистеин) се правят тестове за H2S, като продукт на разцепването на тези аминокиселини от десулфурази. Наличието на H2S също се открива в околната среда на Olkenitsky;
д) за откриване на уреаза, ензим, който разгражда уреята, урея и индикатор се добавят към хранителна среда с неутрално pH. В положителни случаи средата променя цвета си поради изместване на рН към алкалната страна поради образуването на амоняк.Липази- ензими за разграждане на липиди и липоиди. Най-често лецитиназата се определя чрез инокулация върху жълтъчен агар. Лецитиназата разгражда лецитина до фосфохолин и диглицерид. В тези случаи с нарастването на колониите около тях се появяват опалесциращи зони, отразяващи лецитиназната активност.
Ензими-токсини: Хемолизините са ензими, които разцепват фосфолипидната мембрана на еритроцитите. Откриват се чрез посявка върху кръвен агар (5-10%). Има b-хемолиза или пълна хемолиза, когато около колониите се образуват зони на просветление, a-хемолиза, непълна хемолиза, при наличие на зелени зони около колониите. Липсата на хемолиза се нарича d-хемолиза.
Цитотоксини- ензими,има токсичен ефект върху целевите клетки. Например, цитотоксичността на токсина от анаеробни микроорганизми се определя в клетъчна култура. За целта 1 g от материала (изпражнения или др.) се разрежда във фосфатен буфер 1:10 w/v, центрофугира се 30 min при 4000 rpm. Супернатантът се филтрува върху 20 nm филтър, въвежда се в монослой от клетъчна култура на McCoy и се инкубира при 37°C в продължение на 24-48 часа до постигане на токсичен ефект.
Имунохимично определяне на производството на токсини: като правило, методът на ензимен имуноанализ се използва за определяне на много екзотоксини - дифтерия, холера, стафилококи и др. За това се използват тестови системи, базирани на моноклонални антитела към специфичен екзотоксин.
Пазмокоагулазатае ензим, който коагулира животинската кръвна плазма. Определя се в реакция от епруветка. В 1 мл заешка или човешка цитратна плазма (цяла или разредена 2 и 4 пъти с физиологичен разтвор) се разбърква бримка от дневна агарна култура на микроба. Сместа се инкубира в термостат при 37°С. При положителни случаи след 2-4 часа плазмата коагулира (появява се съсирек). Лецитиназа - виж по-горе.
1. Определяне наоксидази. Върху филтърна хартия, навлажнена с 1% разтвор на тетраметил парафенилендиамин, се поставят ивици от тестовата култура в бримка. При положителен случай се появява лилаво оцветяване на ивиците (в рамките на 1 минута).
2.Определяне на каталаза. Капка от 3% разтвор на водороден прекис се нанася върху предметно стъкло и там се въвежда бримка от тестовата култура. В присъствието на каталаза се образуват кислородни мехурчета.
3.Определяне на дехидрази. За наличието на дехидрази се съди по редуциращата способност на микроба, т.е. способността за възстановяване на някои органични багрила (например 1% воден разтвор на метиленово синьо). Към колона захарен агар(донор на водород) добавете багрило (акцептор на водород) и инокулирайте микробната култура чрез инжектиране. В положителни случаи микробът, растящ върху такава среда, я обезцветява.
4.Определяне на спектъра на късоверижни мастни киселини (SCFA),Анаеробните микроорганизми произвеждат междинни продукти, включително късоверижни мастни киселини и алкохоли, спектърът (профилът) на които е различен за различните видове микроорганизми и позволява идентифициране на микроорганизми до родово ниво. Най-често изследваните са оцетната, пропионовата, бутиловата, изобутиловата, валериановата, изовалериановата, капроновата и изокапроновата киселини. За определяне на SCFA се използва методът на газо-течна хроматография. Идентифицирани са микроорганизми като актиномицети, пролионибактерии, еубактерии, бифидобактерии, клостридии.
През последните години бактериологичните лаборатории използват търговски тест системи за бърза биохимична идентификация (определяне на биохимичната активност на различни групи микроорганизми): например 20 теста за ентеробактерии и 30 теста за анаероби. Схемата за идентификация включва следните стъпки:
Колонии ---- Подготовка ---- Приложение ----- Инкубация ---- Отчитане (+ -) ---- Интер-
суспензии суспензии 4 часа 37°C приложение в сряда
Като материал за идентификация се използва добре изолирана колония върху блюдо или чиста култура в епруветка, от която се приготвя суспензия с концентрация на стандарта за оптична плътност N4, след което 55 μl от суспензията се добавят към ямките със средата на тази тест система. Плаката с лентите се инкубира при 37°С в продължение на 4 часа. Отчитането може да се извърши автоматично (с помощта на устройството "ATV") или визуално.Резултатът от биохимичната реакция се оценява като "+" или "-" и се въвежда референтна таблица, в коятоположителен резултат съответства на числов израз, което води до определен цифров профил, съответстващ на специално разработен индекс на аналитичен профил, който ви позволява бързо да идентифицирате един или друг