Биомедицински журнал АНАЛИЗ НА ИЗОБРАЖЕНИЕ НА ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЯ
Физична и химична биология
Клинична медицина
Превантивна медицина
Науки за живота
Основни изследвания
Организация на здравеопазването
История на медицината и биологията
Търсене на публикации
Архив:2000200120022003200420052006200720082009201020112012201320142015201620172 0182019
Редакционна информация:Публикувайте статия
Федерална държавна бюджетна институция за наука "Институт по токсикология на Федералната медико-биологична агенция" (FGBUN IT FMBA на България)
Институт по теоретична и експериментална биофизика на Българската академия на науките.
199406, Санкт Петербург, ул. Гаванская, 49, сграда 2
ТОМ 4, СВ. 131 (стр. 465-470) //
ФЛОУЦИТОМЕТРИЯ АНАЛИЗ НА ИЗОБРАЖЕНИЕ. ПОЛУЧАВАНЕ И ПРЕДСТАВЯНЕ НА ДАННИ
Е. Е. Зуева * Медицински университет в Санкт Петербург. акад. И. П. Павлова, Санкт Петербург, България
РезюмеИмунофенотипизирането на човешки клетки от кръв и костен мозък традиционно се извършва чрез поточна цитометрия и позволява оценката на експресията на няколко маркера едновременно. Използването на многоцветно оцветяване изисква правилна оценка на полученото изображение. Разглеждат се варианти на ко-експресия на маркери по време на трицветно оцветяване. Показана е възможността за оценка на хетерогенността на експресията на маркери върху клетки от една и съща популация по време на анализа.изображения в 2D хистограмно пространство.
Ключови думи:имунофенотипизиране, поточна цитометрия, анализ на изображения
Определянето на фенотипа на клетките- както тези, които циркулират в кръвта, така и тези, които изграждат сложни тъкани, в момента не е трудно. За да направите това, използвайте способността на клетките да се свързват със специфични антитела. Тъй като могат да бъдат получени антитела срещу почти всеки протеин (или негов фрагмент) с установена аминокиселинна последователност или нуклеотидна последователност на съответната ДНК, имунофенотипизирането (IPT) може да се използва в почти всяка област на биологията и медицината 1 . Във всеки случай, антитела, белязани с ензими, метали или флуорохроми, се използват за визуализиране на целевите молекули. Поточната цитометрия (PC), която използва такива стабилни флуорохроми като флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоеритрин (PE), перидинин-хлорофилен протеин (Per CP) и др., като маркер за моноклонални антитела, има почти неограничени възможности за оценка на клетка и нейните компоненти. Откриването на флуоресценцията на всеки от тези флуорохроми и усилването на светлинния сигнал върху фотоумножителите на поточния цитометър дава възможност за едновременно получаване на информация за физическите параметри на клетката (размер и гранулат) и наличието/отсъствието на експресия на определени антигени (маркери) 2 . Напредъкът в технологиите бързо прехвърли проточните цитометри от категорията на научните инструменти към рутинното оборудване на клиниките и превърна самия компютър в златен стандарт на лабораторната диагностика в областта на клетъчното имунофенотипизиране 3 . Анализът на ко-експресията на маркера дава възможност да се определи субпопулацията на лимфоцитите и да се открият туморни клетки в присъствието на нормални клетки.компоненти на кръвта и костния мозък.
Подготовка на пробатаСтандартната подготовка на пробата за откриване на повърхностни маркери на клетки от периферна кръв и костен мозък се извършва съгласно протоколите за оцветяване-лизис-промиване и оцветяване-лизис-не-промиване4. Ако е необходимо да се отложи анализа за 2-24 часа, подготовката на пробата може да бъде допълнена чрез фиксиране на клетките за проба. Ако е необходимо да се открият вътреклетъчни маркери, процедурата за пермеабилизация трябва да бъде включена в протокола за оцветяване 5 . Когато работите с клетъчна суспензия, в която по дефиниция няма еритроцити (например цереброспинална течност или суспензия от мононуклеарни клетки, получена в резултат на градиентно центрофугиране), процедурата на лизис може да бъде изключена от протокола за подготовка на пробата.
Отчитане на резултатитеАнализът на експресията на антиген се извършва на поточен цитометър с помощта на софтуер за анализ на големи данни. Флуоресценцията се възбужда, когато клетката преминава през фокусното петно на аргонов лазер с въздушно охлаждане (мощност 15 mW, излъчвана дължина на вълната 488 nm). Флуоресценцията се взема предвид при 512–547 nm, 572–591 nm и повече от 610 nm за FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 флуоресцентни канали съответно на първия (FL1), втория (FL2) и третия (FL3) фотоумножители. По този начин се получават данни за предно (FSC) и странично (SSC) разсейване на светлината, както и за флуоресценция на клетки, които са свързали флуорохром-конюгирани антитела. Компенсацията на флуоресцентното наслагване се извършва чрез софтуер. Положителността на оцветяването с всяко антитяло се оценява чрез наслагване на квадрантите, определени от отрицателната изотипна контрола.
Представяне на данниДанни за разсейване напред и отстрани на тестови клеткиотразени върху двумерни FSC/SSC хистограми (директно странично разсейване напред (FSC) и ъглово странично разсейване (SSC) разсейване на светлината). Линейното усилване обикновено се използва за FSC и SSC сигнал, флуоресцентните сигнали могат да бъдат усилени до четири (пет) десетилетна логаритмична скала. Логическата граница на лимфоцитната врата се определя от долната и горната стойност на лимфоцитния пик на едномерна хистограма и се прилага за двумерни хистограми. Моноцитната порта докосва лимфоцитната порта с един и половина пъти стойността на SSC. Гранулоцитната врата докосва моноцитната врата и се простира нагоре по цялата ос на SSC. Лявата и дясната граница на моноцитните и гранулоцитните клъстери се определят от съответните пикове на едномерни хистограми. При използване на единичен цветен анализ с различни флуорохроми, сигналите на фотоумножителите FL1, FL2 и FL3 се отразяват в едномерни четиридекадни хистограми. Когато се използва многоцветен анализ, данните за флуоресцентните канали се показват на двуизмерни хистограми от четири десетилетия log/log (FL1/FL2, FL2/FL3 и FL3/FL1). Квадрантите в тези хистограми (FL1/FL2 (FITC/PE), FL2/FL3 (PE/PerCP) и FL3/FL1 (PerCP/FITC)) определят две разделителни линии, фиксирани за всички измервания на една четвърт от флуоресцентната скала по абциса и ордината. За анализ на малки клетъчни популации могат също да се използват смесени линейни логаритмични SSC/FL(1-3) хистограми.
Анализ на данниАнализът на данни се състои в определяне на позицията на клетъчен клъстер в многомерното пространство на поточната цитометрия. Когато клъстер от събития, положителни за двата маркера, се открие на двумерна Fl2/Fl1 хистограма, използването на трицветен етикет позволява да се получат четири варианта на изразяване на третия маркер (фиг. 1.)
С едновременната употреба на три антитела е възможно да се получат осем комбинации от положителни и отрицателни популации (Таблица 1),