Дисков дифузионен метод

Принцип на метода

DDM за определяне на чувствителността се основава на способността на ABP да дифундира от импрегнирани с тях хартиени дискове в хранителна среда, като инхибира растежа на микроорганизми, посяти върху повърхността на агара.

Хранителна среда

За определяне на чувствителността на DDM се използва същата хранителна среда, както при метода на разреждания в агар. За качеството на хранителните среди за настройка на метода на дискова дифузия се поставят същите изисквания, както за твърди хранителни среди за настройка на метода на серийни разреждания в агар; съответно се използват същите методи за контрол на качеството.

Приготвянето на петриеви панички с плътна хранителна среда е свързано с някои особености. Твърдата културална среда се приготвя в съответствие с инструкциите на производителя. Важен момент при определяне на чувствителността на DDM е дебелината на слоя агар в съда. Тя трябва да бъде 4,0 ± 0,5 mm, което се постига чрез добавяне на стриктно 20 ml агар в петриево блюдо с диаметър 90 mm, 25 ml агар с диаметър 100 mm и 60 ml агар с диаметър 150 mm. Преди да се напълнят с разтопена среда, петриевите панички се поставят върху строго хоризонтална повърхност (калибрирана на ниво, без вдлъбнатини и издутини). Тези предпазни мерки са необходими, тъй като размерът и формата на зоната на инхибиране на растежа зависи от дълбочината и еднородността на слоя агар.

След напълване чашите се оставят на стайна температура да стегнат. Чашите могат да се съхраняват затворени в найлонови торбички при + 4 - + 8 °C за 7 - 10 дни. Когато се използват прясно приготвени чаши или чаши след съхранение в хладилник, те трябва да бъдат изсушени преди инокулация, което се постига чрез инкубация при 35 °C с открехнат капак за 10 - 20 минути. Преди инокулация,проверете липсата на течен кондензат по вътрешната повърхност на капаците.

Антибиотични дискове

За да се определи чувствителността на DDM, трябва да се използват само дискове със стандартно качество. Производството на дискове с ABP, необходими за определяне на чувствителността по дисково-дифузионен метод, не е практично в лабораторни условия. Това се дължи на строгите изисквания към суровините (ABP вещества, картон) и значителната трудоемкост на методите за контрол на качеството на диска.

Дългосрочното съхранение на дискове с ABP се извършва в запечатана опаковка във фризер при температура -18 ° C и по-ниска. Малки партиди дискове, използвани в ежедневната работа, могат да се съхраняват в хладилник при температура от + 4 - + 8 ° C, плътно затворени, така че да е невъзможно да навлезе влага във флакона, освен това, за допълнителна защита от влага, флаконите (патроните) с търговски произведени дискове съдържат специален десикант (силикагел).

Флаконите (патроните) с дискове трябва да се извадят от хладилника 1 час преди работа и да се съхраняват херметически затворени до достигане на стайна температура, което предотвратява образуването на конденз върху дисковете след отваряне на флаконите.

Приготвяне на бактериална суспензия и инокулация

Тестването за чувствителност към DDM използва стандартен инокулум, съответстващ на плътност от 0,5 McFarland и съдържащ приблизително 1,5 x 108 cfu/ml. Инокулумът трябва да се използва в рамките на 15 минути след приготвянето. Могат да се използват два метода за инокулиране на подготвени плочки с агар.

Най-удобният метод за инокулация е използването на търговски стерилни памучни тампони. Необходим е тампонпотопете в стандартна суспензия на микроорганизма, след което отстранете излишния инокулум, като притиснете тампона към стените на епруветката. Инокулацията се извършва чрез ударни движения в три посоки, завъртане на петриевото блюдо на 60°.
При използване на втория метод стандартен инокулум се нанася с пипета върху повърхността на петриево блюдо с хранителна среда в обем от 1-2 ml, равномерно разпределена по повърхността чрез разклащане, след което излишъкът от инокулум се отстранява с пипета. Отворените чаши се сушат при стайна температура за 10-15 минути.

Дисково приложение и инкубация

Не по-късно от 15 мин. След инокулацията върху повърхността на хранителната среда се нанасят дискове с ABP. Дисковете се поставят със стерилна пинсета или автоматичен дозатор. Разстоянието от диска до ръба на чашата и между дисковете трябва да бъде 15 - 20 мм. По този начин не трябва да се поставят повече от 6 диска с ABP на една чаша с диаметър 100 mm. Дисковете трябва да са равномерно в контакт с повърхността на агара, за което трябва да бъдат леко притиснати с пинсети.

Непосредствено след поставянето на дисковете петриевите панички се поставят в термостат с главата надолу и се инкубират при 35°C за 18-24 часа (в зависимост от вида на изследвания микроорганизъм). Увеличаването на интервала от време между прилагането на дискове върху повърхността на средата и началото на инкубацията (и съответно началото на растежа на изследваната култура на микроорганизма) води до "предварителна дифузия" на ABP в агара и до увеличаване на диаметъра на зоната за инхибиране на растежа.

Отчитане на резултатите

След приключване на инкубацията съдовете се поставят обърнати надолу върху тъмна матова повърхност, така че светлината да пада върху тях под ъгъл 45° (броене в отразена светлина). Диаметърът на зоните на забавяне на растежа се измерва с точност до 1 mm, за предпочитане е да се използва дебеломер илишублери.

Когато се измерват зоните на инхибиране на растежа, трябва да се съсредоточите върху зоната на пълно потискане на видимия растеж. Игнорирайте много малки колонии, откриваеми само в зоната на спиране на растежа при специални условия на осветеност или увеличение, и едва забележим цъфтеж в края на зоната. Изключение правят случаите на отчитане на резултатите от определяне на чувствителността на стафилококи към оксацилин, когато е необходимо да се вземат предвид най-малките колонии, открити в ясна зона на потискане на растежа.

Големи колонии, открити в ясна зона на инхибиране на растежа, показват наличието на чужда микрофлора или хетерорезистентност на популацията от микроорганизми, в който случай е необходимо да се повтори идентифицирането на микроорганизма, който образува тази колония, и да се определи чувствителността на този щам.

При определяне на DDM чувствителността на роящите се щамове Proteus зоната на инхибиране на растежа може да бъде покрита с тънък воал, подобен на филм, който не пречи на установяването на границата на зоната и не се взема предвид при регистриране на резултатите.

При определяне на чувствителността към сулфонамиди и тяхната комбинация с триметоприм трябва да се вземе предвид границата на зоната на инхибиране на растежа при ниво на инхибиране на растежа с 80%. Това се дължи на факта, че под действието на тези лекарства, преди пълното потискане на растежа, е възможно да се завършат 1-2 цикъла на пролиферация на микроорганизма.