Генна терапия с трансгенни клетки
Терапията с трансгенни клетки с прицелен генно-инженерен конструкт може да се нарече комбинирана терапия. За неговото прилагане е необходимо да се въведе целевият ген в клетката. Тази комбинация съчетава свойствата на клетъчен вектор, генна функция и ефекта на клетъчната терапия.
Трансгенозата (трансфер на генетичен материал) in vitro е насочена към соматични таргетни клетки, предварително изолирани от тялото (например резециран черен дроб, култура от лимфоцити или фибробласти, костен мозък, туморни клетки). Използвани са много подходи за въвеждане на ДНК в клетки на бозайници: химически (микропреципитати на калциев фосфат, DEAE-декстран, диметилсулфоксид), клетъчно сливане (микроклетки, протопласти), физически (микроинжекции, електропорация, лазерно микроинжектиране) и вирусни (ретровируси, аденовируси, адено-асоциирани вируси). Невирусните методи, с изключение на електропорацията и лазерното микроинжектиране, са неефективни. Най-ефективните преносители на ДНК в клетките са "естествените спринцовки" - вирусите.
Процедурата за клетъчна трансгенеза трябва да завърши с проверка на нейния успех. Трансгенезата може да се счита за успешна, ако най-малко 5% от всички третирани клетки имат въведения генетичен материал.
Последната процедура на генна терапия чрез in vitro трансгенеза на соматични клетки е реимплантирането на трансгенни целеви клетки. Тя може да бъде органотропна (чернодробните клетки се инжектират през порталната вена) или извънматочна (клетките от костен мозък се инжектират през периферна вена).
Клетъчната генна терапия е приета в клиничната практика по-бързо от очакваното. Варианти на неговото приложение могат да бъдат показани на примера на три заболявания.
Дефицит на аденозин дезаминаза. Лимфоцити на болно момиче на 4 години (САЩ), страдащо от първичен имунен дефицит,причинени от мутация в гена на аденозин деаминазата, бяха предварително отделени от останалите кръвни елементи и Т-лимфоцитите бяха стимулирани да растат. След това, in vitro, генът на аденозин деаминазата беше въведен в тях с помощта на ретровирусен вектор. Така подготвените генетично модифицирани лимфоцити бяха върнати в кръвния поток.
От протокола на клиничното изпитване стана ясно, че първо, лимфоцити от тежко имунокомпрометирани пациенти могат да бъдат изолирани и отгледани в лаборатория. В тях може да се въведе ген и да се върне в кръвта на пациента. Второ, лечението на пациента е било ефективно. Общият брой на лимфоцитите се повишава до нормата, а активността на аденозиндеаминазата в Т-лимфоцитите се повишава до 25% от нормата. Момичето беше прибрано от стерилната кутия. Трето, в продължение на 6 месеца преди следващия курс на лечение броят на генетично модифицираните лимфоцити и активността на ензима в клетките остават постоянни.
Изборът на заболяване, за да започне използването на генна терапия, беше добре обмислен. Генът на аденозин деаминазата към този момент е бил клониран, имал е среден размер и бил добре интегриран в ретровирусни вектори. По-рано, по време на трансплантация на костен мозък при дефицит на аденозин деаминаза, беше показано, че Т-лимфоцитите играят ключова роля в развитието на заболяването. Следователно генната терапия трябва да бъде насочена към тези целеви клетки. Важен момент беше, че функционирането на имунната система е възможно при активност на ензима, която е 5-10% от контролния показател. И накрая, генетично модифицираните Т-лимфоцити имат селективно предимство пред оригиналните дефектни клетки. В момента около 50% от децата с дефицит на аденозин деаминаза се лекуват с генна терапия.
Семейна хиперхолестеролемия. LDL рецептори, които играят ключова роляроля в метаболизма на холестерола, синтезиран в чернодробните клетки. В тази връзка генната терапия трябва да бъде насочена към хепатоцитите (прицелните клетки). Опит за такова лечение е направен в САЩ при 29-годишна жена с тежка атеросклероза на коронарните артерии. Ефектът от предишното оперативно шунтиране вече е преминал. Братът на пациента починал от същото заболяване, преди да навърши 30 години.
Генната терапия е проведена на няколко етапа. Пациентът е подложен на частична (около 15%) хепатектомия. Отстраненият дял на черния дроб се промива с разтвор на колагеназа за отделяне на хепатоцитите и се получават около 6 милиона клетки. Те са отгледани в 800 културни чаши върху хранителна среда. По време на растежа в култура се използва ретровирусен вектор за включване на нормалния LDL ген в клетките. За да могат клетките да достигнат черния дроб, трансгенните хепатоцити бяха събрани и инжектирани в пациента чрез катетър в порталната вена. Няколко месеца по-късно чернодробна биопсия разкрива, че новият ген функционира в някои клетки. Съдържанието на LDL в кръвта намалява с 15-30%. Подобряването на състоянието на пациента позволява лечение само с лекарства, които намаляват концентрацията на холестерол.
Хемофилия А. Публикувани са резултати от лечението на шест пациенти с хемофилия. От всеки пациент се получава и отглежда култура от кожни фибробласти, която след това се трансфектира с плазмид, съдържащ последователността на гена, кодиращ фактор VIII. Клетките, които го произвеждат, бяха избрани, клонирани, разширени и инжектирани в оментиума чрез лапароскопска инжекция. Не са докладвани усложнения при пациентите. При четирима пациенти, в продължение на 10 месеца, концентрацията на фактор VIII е по-висока, отколкото преди лечението, и добро състояние се поддържа с екзогеннивъвеждане на намалена доза от фактора. Експерименталните проучвания показват възможността за коригиране на съдържанието на фактор VIII след трансплантация на автоложни хемопоетични клетки, трансфектирани с генетичен конструкт с нуклеотидната последователност на гена на фактор VIII.
Рак. Необичайно бързият напредък в изследването на човешкия геном и методите на генното инженерство позволява разработването на генна терапия не само за моногенно наследствени заболявания, но и за мултифакторни заболявания като рак. Генната терапия за злокачествени новообразувания вече е започнала, въпреки че има много трудности по пътя й поради необходимостта да се осигури селективност, специфичност, чувствителност и безопасност на генния трансфер.
Понастоящем се използва следната стратегия за генна терапия на рака:
Въпреки привидното обещание за различни варианти на генна терапия за туморни заболявания и обнадеждаващите експериментални данни, резултатите от клиничните изследвания са много противоречиви и не са получени забележими ефекти. Може би това се дължи на началото на лечението на рак в много напреднал стадий. Както е известно, няма съществени постижения и при лечението на злокачествени новообразувания с други биологични методи. Изключение правят меланомите (имунобиологичен подход) и глиобластомите (генна терапия). Генната терапия на рака е огромен клон на съвременната медицина, но е много трудно да се предвиди развитието му.
Областта на генната терапия на рака преминава през етап на „тромав тийнейджър“. Тази посока все още не е достигнала зрялост и вероятно има голям потенциал. В Китай две лекарства за генна терапия вече са официално одобрени за лечение на тежки форми на рак на шията и главата (gendicinp и H101p).