Култивиране на спирохети и протозои
Сред спирохетите е най-лесно да се отглеждат лептоспири, хранителната среда за които може да бъде вода, смесена със серум от заешка кръв. Borrelia и treponema се култивират при анаеробни условия върху по-сложни хранителни среди, съдържащи серум, парчета животински тъкани.
От протозоите върху хранителни среди се култивират дизентерийна амеба, Giardia, Trichomonas, Leishmania, Trypanosoma, Balantidia.Toxoplasma се култивира в пилешки ембриони и тъканни култури. Разработват се методи за култивиране на маларийни плазмодии.
Методи за изследване на ензимната активност (биохимични свойства)
В микробиологичната практика изследването на ензимната активност се използва за идентифициране на микроорганизми, тъй като всеки микробен вид има определен набор от ензими.
За да се определи протеолитичната активност, микробите се инокулират с инжекция в желатинова колона и след 3-5 дни инкубация при стайна температура се отбелязва естеството на втечняването на желатина: под формата на фуния, гвоздей, чорап или под формата на преобърнато коледно дърво. Протеолитичната активност също се определя от образуването на продукти от разпадането на протеини: индол, сероводород, амоняк. За определянето им микроорганизмите се инокулират в месно-пептонен бульон и между гърлото на епруветката и памучен тампон се поставят индикаторни хартии, като се изключва контактът им със средата. С образуването на индол хартията, импрегнирана с наситен разтвор на оксалова киселина, придобива розов цвят; в присъствието на сероводород хартията, импрегнирана с оловен ацетат, става черна; когато се образува амоняк, червената лакмусова хартия става синя.
За определяне на захаролитичните свойства на микробите се използват диференциални диагностични среди, като среда на Hiss, среда на Olkenitsky, среда на Endo, среда на Levin,Сряда Плоскирев.
Средите на Ендо, Левин, Плоскирев в петриеви панички се използват за разграничаване на бактериите от чревната група според способността им да ферментират лактоза. Тези среди съдържат хранителен агар, лактоза и индикатор, който променя цвета си в кисела среда - pH индикатор. Ако бактерии, които ферментират лактоза, като Escherichia coli, се засяват върху такава среда, в резултат на ферментацията на лактоза се образува киселина и индикаторът ще промени цвета си в кисела среда. Следователно колониите от Escherichia coli върху такава среда ще бъдат оцветени според цвета на индикатора: върху средата на Ендо и средата на Плоскирев - в червено, върху средата на Левин - в черно и синьо. Колониите от неферментиращи лактоза бактерии като салмонела и дизентериен бацил ще бъдат безцветни.
Средите на Hiss (среди от "пъстрата серия") се приготвят на базата на пептонна вода или полутечен месно-пептонен агар. Съдържа всеки един въглехидрат или поливалентен алкохол и индикатор. Когато микроб расте върху среда на Hiss, ферментирайки този субстрат с образуването на киселина и газ, средата ще промени цвета си, ще се появят мехурчета и разкъсвания в дебелината на агара в полутечна среда и газов мехур в стъклен поплавък ще се появи в течна среда. Когато субстратът ферментира само до киселина, настъпва само промяна в цвета на средата.
Използват се и комбинирани среди, съдържащи не един въглехидрат, а два или три, например средата на Олкеницки. Една епруветка от тази среда замества наклонена агар и среда на Hiss с лактоза, глюкоза и захароза. След стерилизация в разтопено състояние средата в епруветката се скосява, така че да се получи колона и скосена част. Засяването се извършва чрез щрих по скосената част и инжектиране в колона. При ферментация на лактоза или захароза цветът на цялата среда се променя; при ферментация само на глюкоза се променя само цветът на колоната.Образуването на газ се определя от наличието на мехурчета в агаровата колона. Когато амонякът се отделя от микроби, цветът на средата не се променя. Образуването на сероводород се проявява чрез почерняване в агарната колона.
За експресния метод за определяне на ензимната активност на бактериите се използват микротест системи и хартиена индикаторна система (SIB).
Системата за микротест е контейнер, изработен от прозрачен полистирол, състоящ се от няколко клетки.Клетките съдържат изсушена хранителна среда с въглехидрати и pH индикатори.Във всяка клетка се инокулира суспензия от бактериална култура с определена плътност.Физичният разтвор се излива в контролните клетки.Резултатът се отчита след 3-4 часа инкубация в термостат чрез промяна на цвета
Хартиените индикаторни системи (SIB) за идентифициране на семейството ентеробактерии са дискове или ленти от хроматографска хартия, покрити със защитен филм и съдържащи специфичен субстрат и индикатор.Тестовата култура се въвежда в епруветки с физиологичен или буферен разтвор, след което се поставят дисковете.Бактериалната култура не се добавя към контролните епруветки.Резултатът се отчита по промяната на цвета на индикатора.
Във всички епруветки предварителният резултат се взема предвид на същия ден, а крайният резултат се взема предвид на следващия ден.
Оксидазната активност се определя чрез триене на културата върху индикаторна хартия.Резултатът се отчита след минута.
ГЛАВА 6.
ОБЩА ВИРУСОЛОГИЯ
Общи характеристики на вирусите, морфология
И структурата на вирионите
Откривател на вирусите, основоположник на вирусологията е българският учен Дмитрий Йосифович Ивановски,открива вируса на тютюневата мозайка (TMV) през 1892 г
Вирусите са толкова различни от микроорганизмите, че са изолирани в отделно царство - царството на Вира
Характеристики на вирусите, които ги отличават от всички други живи същества
1) наличието само на един вид нуклеинова киселина - ДНК или РНК, докато клетките на всички останали живи същества съдържат ДНК и РНК, чието взаимодействие е необходимо за биосинтезата на протеини,
2) липсата на собствени протеин-синтезиращи системи и клетъчна структура;
3) вътреклетъчен паразитизъм на молекулярно (генетично) ниво.
Извънклетъчната форма на вируса - вириоус и вирусът вътре в клетката гостоприемник - са две различни форми на вируса.
Вирионите на различни вируси имат размери от 15 до 400 нанометра. Един нанометър е 10 -9 метра (фиг. 6). Най-малките вируси - полиомиелитни вируси - имат вирион с размер 17-25 nm, среден - грипен вирус - 80-120 nm, голям - вирус на едра шарка - 300-400 nm.
В центъра на вириона е неговият геном. Това е нуклеинова киселина - ДНК или РНК (едноверижна или двуверижна). Плюс-едноверижната РНК има две функции: наследствена и информационна, например при полиомиелитния вирус. Отрицателната едноверижна РНК, както например при грипния вирус, има само наследствена функция и само в процеса на възпроизвеждане на вируса към нея се допълва плюс-верига от иРНК.
Около нуклеиновата киселина симетрично разположени протеинови молекули - капсомери, които изграждат капсида (лат. capsa - кутия). Прави се разлика между спираловиден тип симетрия, когато капсомерите са разположени по цялата дължина на молекулата на нуклеиновата киселина, и кубичен тип, когато капсомерите са подредени под формата на двадесет страни (икозаедър).
Вирионите, съдържащи само нуклеинова киселина и протеин, изграждат нуклеокапсида. Това са прости вируси, напр.TMV, вирус на полиомиелит.
Вирионите на сложно организираните вируси също имат повърхностна обвивка - суперкапсид, съдържащ освен протеини и въглехидрати, липиди, компоненти на клетката гостоприемник. Структурата на вириона е в основата на класификацията на вирусите. Според вида на нуклеиновата киселина се делят на: рибовируси и дезоксирибовируси, след това според структурата на вирионите, според мястото на размножаване и според други признаци се делят на семейства и родове.
Поради малкия си размер вирусите не се виждат под светлинен микроскоп. Само най-големият от тях - вирусът на едра шарка - може да се наблюдава под формата на малки точкови образувания - елементарни тела на Пашен.
Възпроизвеждайки се в чувствителни клетки на тялото, вирусите на едра шарка, бяс, грип образуват вътреклетъчни включвания в тях. Те могат да бъдат открити под светлинен или флуоресцентен микроскоп. За диагностика се използва откриване на вътреклетъчни включвания. Например, включвания на Babesh-Negri в нервните клетки се откриват при бяс.
Морфологията на вирионите се изследва под електронен микроскоп. Вирусите имат различна форма: сферична, нишковидна, пръчковидна.
Възпроизвеждане на вируси
Вирусите не могат да се размножават върху хранителни среди - те са стриктни вътреклетъчни паразити. Освен това, за разлика от рикетсията и хламидията, вирусите в клетката гостоприемник не растат и не се размножават чрез делене. Компонентите на вируса - нуклеиновите киселини и белтъчните молекули се синтезират поотделно в клетката гостоприемник, в различни части на клетката - в ядрото и в цитоплазмата. В същото време клетъчните протеин-синтезиращи системи се подчиняват на вирусния геном, неговия NK.
Възпроизвеждането на вируса в клетката протича в няколко фази (фиг. 7):
- Първата фаза е адсорбцията на вируса върху повърхността на клетката, чувствителна към този вирус.
-Втората фаза е проникването на вируса в клетката гостоприемник чрез виропексис.
- Третата фаза е "събличането" на вирионите, освобождаването на нуклеиновата киселина на вируса от суперкапсида и капсида. При редица вируси проникването на нуклеиновата киселина в клетката става чрез сливане на вирионната обвивка и клетката гостоприемник. В този случай втората и третата фаза се комбинират в една.
В зависимост от вида на нуклеиновата киселина този процес протича по следния начин.
ДНК-съдържащ (ДНК->иРНК->протеин)
1. Размножаването се извършва в ядрото: аденовируси, херпес, папо-вавируси. Използвайте ДНК-зависима РНК - клетъчна полимераза.
2. Възпроизвеждането става в цитоплазмата: вирусите имат своя собствена ДНК-зависима РНК полимераза. РНК-съдържащи.
1. Рибовируси с положителен геном (плюс-нитиум): picor-
на-, тога-, коронавируси. Няма транскрипция.
2. Геномно-отрицателни рибовируси (с минус резба): грип,
морбили, паротит, орто-, парамиксовируси.
(-)РНК ->тРНК ->протеин (тРНК, комплементарна на (-)РНК) Този процес протича с участието на специален вирусен ензим - вирионна РНК-зависима РНК полимераза (такъв ензим не може да има в една клетка).
(-)РНК -> ДНК - > иРНК -> протеин (и РНК е хомоложна на РНК) В този случай процесът на образуване на ДНК на базата на (-) РНК е възможен с участието на ензима - РНК-зависима ДНК полимераза (обратна транскриптаза или обратна транскриптаза)
- Четвъртата фаза е синтеза на вирионни компоненти. Нуклеиновата киселина на вируса се произвежда чрез репликация. Информацията на вирусната иРНК се транслира в рибозомите на клетката и в тях се синтезира специфичен за вируса протеин.
- Петата фаза е сглобяването на вириона. Нуклеокапсидите се образуват чрез самосглобяване.
- Шеста фаза - освобождаване на вириони от клетката.Простите вируси, като полиомиелитния вирус, унищожават клетката, когато излязат. Сложните вируси, като вируса на грипа, излизат от клетката чрез пъпкуване. Външната обвивка на вируса (суперкапсид) се образува по време на освобождаването на вируса от клетката. Клетката по време на този процес остава жива известно време.
Описаните видове взаимодействие на вируса с клетката се наричат продуктивни, тъй като водят до производството на зрели вириони.
Друг начин - интегративен - е, че след проникване на вируса в клетката и "събличане" вирусната нуклеинова киселина се интегрира в клетъчния геном, тоест тя се интегрира в клетъчната хромозома на определено място и след това се репликира заедно с нея под формата на така наречения провирус. За вирусите, съдържащи ДНК и РНК, този процес протича по различни начини. В първия случай вирусната ДНК се интегрира в клетъчния геном. При РНК-съдържащите вируси първо се осъществява обратната транскрипция: ДНК се образува върху шаблона на вирусната РНК с участието на ензима "обратна транскриптаза", който се интегрира в клетъчния геном. Провирусът носи допълнителна генетична информация, така че клетката придобива нови свойства. Вирусите, способни на този тип взаимодействие с клетката, се наричат интегративни. Интегративните вируси включват някои онкогенни вируси, вирус на хепатит В, херпесен вирус, вирус на човешка имунна недостатъчност, умерени бактериофаги.
В допълнение към обикновените вируси има приони - протеинови инфекциозни частици, които не съдържат нуклеинова киселина. Приличат на фибрили с размер до 200 nm. Те причиняват бавни инфекции при хора и животни с мозъчни увреждания: болест на Кройцфелд-Якоб, куру, скрейпи и др.