Култивиране на вируси в клетъчна култура - Основи на ветеринарната вирусология - Информация
Култивиране на вируси в клетъчна култура
Клетъчните и тъканните култури са части от органи и тъкани, отгледани в хранителна среда извън тялото, остават жизнеспособни, а някои се размножават.
За отглеждане се нуждаете от:
- изходен материал (тъкани на ембриони, клетки на бъбреците, кожата, далака). Задължително спазване на правилата за асептика и антисептика;
- температурата трябва да бъде 36 -38 градуса по Целзий;
- хранителна среда, която трябва да има буферност и изотоничност, т.е. включват Na, K, Ca, Mg, Cl, фосфати, карбонати;
- pH на средата трябва да бъде 7,2 - 7,4 единици;
- всички хранителни вещества, особено глюкозата, която е отговорна за енергийния метаболизъм;
- витамини, които са коензими.
Средите са два вида:
1. естествени или естествени (кръв, околоплодна течност);
2. 2. синтетични и полусинтетични (от химикали, солеви разтвори - разтвор на Ърл и разтвор на Ханкс)
Методологията се свежда до следното:
1. селекция на клетъчна култура;
2. получаване на вирусосъдържащ материал;
3. подготовка за заразяване;
4. заразяване на клетки с материал, съдържащ виброгар;
5. култивиране на вируса в клетки;
6. индикация на вируса в клетъчна култура;
7. вземане на културална течност и идентифициране на вируса в нея.
Селекция на клетъчни култури. Не всяка клетка е чувствителна към всеки вирус. Вирусът към първичната култура обикновено се адаптира успешно, при условие че културата е получена от органи на животно, естествено податливо на този вирус. Въпреки това, адаптирането на вируса към трансплантирани клетки е по-сложно и в някои случаи невъзможно. За култивирането на някои вируси досегане е известна клетъчна система. За култивиране на вируси обикновено се използват млади клетки, т.е. в първия ден от образуването на монослой, а в някои случаи (за свински парвовируси) клетките се заразяват по време на засяване, тъй като вирусът се размножава интензивно в присъствието на делящи се клетки (когато са в етап на логаритмичен растеж).
За тази цел се избират епруветки (или дюшеци) с непрекъснат клетъчен монослой, като се разглеждат под микроскоп с ниско увеличение. Растежната среда се отцежда, клетките се промиват 1-2 пъти с разтвор на Hank за отстраняване на серумните антитела и инхибитори. Във всяка епруветка се добавят 0,1-0,2 ml материал, съдържащ vibolgar, и чрез разклащане се разпределя равномерно върху клетъчния слой. В тази форма епруветките (матраците) се оставят за 1 до 2 часа при 22 или 37 °C, за да се адсорбира вируса върху клетъчната повърхност.След това материалът, съдържащ виболгар, се отстранява от епруветките (матраците) и се излива поддържащата среда (1-2 ml в епруветката, около 10% от обема й в матраците).Когато вирусът се изолира от патологичния материал, някои проби (изпражнения и др.) могат имат токсичен ефект върху клетките, следователно след адсорбция вирусът и клетъчният монослой се промиват 1-2 пъти с разтвор на Ханк (или хранителна среда) и след това се излива поддържащата среда.
Епруветките (матраците) се затварят херметически с гумени запушалки и се поставят за инкубиране в термостат при 37 °C. Най-широко използваната стационарна инкубация. В този случай дюшеците се поставят в хоризонтално положение, епруветките се поставят под ъгъл от 5 °, така че клетъчният монослой да е под хранителната среда (линията нагоре). В редица лаборатории заразените клетъчни култури се инкубират на ротационна система - ролки. Използвайки този метод, е възможно да се получи голям добив на вируса, който има по-висок инфекциозен титър, отколкото пристационарно отглеждане.
За всяка проба от материал обикновено се използват поне 4-10 епруветки за клетъчни култури. За контрол се оставят 4-6 епруветки с незаразена клетъчна култура, в които растежната среда се заменя с поддържаща.
В култури от клетки, заразени с вирус, хранителната среда може да се остави непроменена в продължение на 7 дни и pH на средата (6,9–7,4) може да се поддържа с 7,5% разтвор на натриев бикарбонат. При по-продължително култивиране на заразени клетки (аденовируси и др.) средата се сменя.
Всички епруветки (матраци) след клетъчна инфекция се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение, като се сравняват инфектирани с вирус клетъчни култури с контроли.
В термостата вирусните частици, адсорбирани върху клетките, проникват в тях и започва тяхното размножаване. Новите вирусни частици напускат (изцяло или частично) клетките, в които са се образували, проникват в незасегнати клетки, възпроизвеждат се в тях, преминават в нови клетки и ги заразяват. Това продължава, докато има живи непокътнати клетки. В резултат на този процес почти всички клетки в матрак или епруветка са засегнати от вируса, въпреки че абсолютно всички почти никога не са засегнати.
Анатомия фиг. 4 Дихателната система на човека се състои от тъкани и органи, които осигуряват белодробна вентилация и белодробно дишане. Дихателните пътища включват: нос, носна кухина, назофаринкс, ларинкс, трахея, бронхи и бронхиоли. Белите дробове са съставени.
Влияние на осветеността, нивото и течението на водата върху рибите Теченията влияят върху физическите, химичните и биологичните процеси, протичащи във водоемите. Топлите течения, носещи топлина в зоните със студена вода, създават благоприятни условия за развитието на хранителни организми и следователно за ри.
Описание Главаконете са удължени, сухи, с големи живи очи, широки ноздри и големи или средно големи заострени и много подвижни уши. Домашният кон има уши с умерен размер (много по-малко от половината на главата). Гривата е дълга.