Лабораторни методи за диагностика на специфични алергии
Тези методи могат да се използват широко при алергични заболявания в острата фаза, по време на периоди на масивен контакт с алергена, с висока чувствителност на болния към алергена, при наличие на противопоказания, при деца, при идентифициране на професионални алергични заболявания, тъй като те изключват възможността за неспецифични, фалшиви алергични реакции.
Сред различните методи за специфична алергодиагностика в реагинов IgE-зависим тип, определянето на моноклонален IgE е по-предпочитано.
Съществуват индиректни методи за определяне на IgE и най-често срещаните директни методи за откриване на специфични IgE, базирани на нови технологии и използване на диагностикуми под формата на стандартизирани и сертифицирани алергени към тях.
Реакцията на пасивен трансфер според Praustnitz-Küstner(индиректен метод за кожно изследване) се използва по-често в педиатричната практика при идентифициране на хранителни алергии. Същността на метода се състои в реакцията на пасивно предаване на реципиента на сенсибилизация чрез интрадермално инжектиране на 0,1 ml кръвен серум на пациента с наличието на предполагаем специфичен IgE в него. След 24 часа в същата област се инжектират 0,02 ml от предполагаемия алерген. Реакцията се записва след 20 минути. Заплахата от предаване на СПИН, вирусен хепатит и други инфекции обаче не позволява този метод да се използва широко.
Определяне на специфичен IgE
Изследването на общия IgE се извършва с помощта на хартиен радиоимуносорбентен тест (метод PRIST), определянето на алергоспецифичен IgE е радиоалергосорбентен тест (метод RAST). Наред с тях за определяне на алергоспецифични IgE все по-широко се използва методът на имуноензимен анализ (ELISA).
Методът RAST е най-специфичният иточен, тъй като се основава на използването на радиоактивен етикет. Същността му се състои в свързването на специфичен IgE на изследвания серум с алерген, поставен върху хартиена чиния. След измиване на неспецифичния (тотален) IgE, към съдържанието се добавят маркирани с 125I анти-IgE антитела. Полученият радиоактивен комплекс се отчита на сцинтилационен брояч.
Серумът на субекта, съдържащ специфичен IgE, се наслоява върху полистиреновата повърхност на микроплака с адсорбиран набор от алергени, които свързват само определени специфични IgE.
При точков имуноанализ алергените се прилагат като точки върху нитроцелулозни дискове.
Заедно с идентифицирането на специфичен IgE се използват и други лабораторни тестове за диагностициране както на реакции, зависими от антитела (определяне на показатели за специфично увреждане на базофилите, алергични антитела в реакцията на пасивна хемаглутинация, реакция на фиксиране на комплемента и др.), И реакции от забавен (клетъчен) тип (реакция на инхибиране на миграцията на кръвни левкоцити - RTML, тест на клетки, образуващи розетка - ROK, тест за увреждане на неутрофилите и др.).
Използването им в алергологичната практика не е загубило своето значение - идентифицирането на свръхчувствителност към алергени, автоантигени позволява по-целенасочено лечение и рехабилитация на пациентите.
Реакцията на директно специфично увреждане на кръвните базофили
Кръвните базофили, мастоцитите са таргетни клетки при осъществяването на алергични реакции от незабавен тип. lgE с помощта на Fc фрагмента се фиксират върху рецепторите на мембраните на тези клетки и с помощта на Fab фрагмента те специфично реагират с алергена. Това е придружено от рязко активиране (дегранулация) на целевите клетки, което се използва катомаркер за алергична реакция.
За да се установи реакцията, 5 ml от тестовата кръв се добавят към центрофужна епруветка с 5 капки 6% воден разтвор на Trilon B и се инкубират за един час при 37 °C. Получената суспензия от левкоцити се прехвърля с пипета на Пастьор в чиста епруветка и след това се излива в две центрофужни епруветки от 0,3 ml. В първата епруветка (експериментална) добавете 0,1 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид, в който е разтворена работната доза на алергена, във втората (контролна) - 0,1 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид без алергена.
И двете епруветки се инкубират за 10 минути при 37°C, след което се центрофугират за 10 минути при 1500 rpm. След това супернатантната течност се отцежда и левкоцитната маса, останала на дъното на епруветката, леко се разклаща, се разбива в остатъка от течността, изтичаща от стените. С помощта на пипета на Пастьор съдържанието на всяка епруветка се прехвърля в отделни предметни стъкла (под формата на капка по ръба) и се приготвят тънки левкоцитни петна с помощта на шлифования ръб на друго стъкло.
Намазките се оцветяват с еозин-метиленово синьо според May-Grunwald за 1-2 минути след изсушаване на въздух. След промиване на препарата в метилов алкохол, петна-лекарства се микроскопират с потапяне (увеличение 10 х 80). 50 базофили се преброяват по краищата на намазката и броят на увредените средни клетки. Индексът на увредените клетки в опитните и контролните препарати се определя по формулата:
Реакцията се счита за положителна с показател от 1,4 и повече.
Ел Ей Дуева и др. (1986) избират работните концентрации и дози на химически алергени и антибиотици за реакцията на пряко специфично увреждане на кръвните базофили (Таблица 4).
Тест за разрушаване на мастоцитите
За да получите суспензия от мастоцити, въведетеинтраперитонеално на плъх 8-10 ml (мишки - 2-5 ml) изотоничен разтвор на натриев хлорид, загрят до 37 ° C, приготвен в 0,15 mol фосфатен буфер с рН 7,2, леко масажирайте стомаха. Суспензията от мастни клетки се промива с изотоничен разтвор на натриев хлорид, след което се центрофугира при 500 rpm.
Суспензията от мастни клетки (0,02 ml) и серумът на пациента (0,02 ml) се инкубират за 15 минути при 37°C, след това се добавят 0,02 ml от алергена при предварително избрана концентрация и отново се инкубират за 15 минути при 37°C. Приготвят се едновременно три контроли: мастоцити без серум и без алерген; мастоцити със серум без алергени; мастоцити с алерген без серум.
След оцветяване на пробите с 0,025% разтвор на толуидиново синьо или 0,3% разтвор на неутрално багрило, камерите на Горяев се пълнят със суспензия от мастоцити и оцветените клетки се преброяват, като се сравнява броят на гранулираните клетки в контролата и експеримента. Наблюдаваната дегранулация на мастоцитите в тестовата проба се счита за слабо положителна при наличие на 10-20% дегранулация, положителна - при 21-40%, силно положителна - при дегранулация на повече от 40% от клетките в сравнение с контролата.
Концентрацията на алергени, която не предизвиква спонтанна дегранулация, за антибиотици - 100-1000 U / ml, калиев дихромат и йодид, натриев хромат, никелов сулфат - 0,01-0,1% разтвор, формалдехид - 0,2-0,4%. Използват се битови алергени в доза от 10 до 100 PNU.
Тестът за пасивна хемаглутинация (RPHA) ви позволява да откриете антитела срещу водоразтворими и водонеразтворими алергени.
Реакцията се основава на феномена на аглутинация на еритроцити, сенсибилизирани in vitro към химически алергени, когато се добави серум на пациента, съдържащ анти-хаптенови антитела.
Реакция на инхибиране на миграцията на левкоцититекръв (RTML) се основава на способността на сенсибилизирани Т-лимфоцити (например към хаптени) да секретират лимфокин, фактор, който инхибира миграцията на левкоцитите. С помощта на RTML се разкрива реакция от клетъчен тип (независима от антитела) към различни антигени.