Метод за определяне на алкохолдехидрогеназната активност
Употреба: в експерименталната биология, медицина и биохимия. Същността на изобретението: приготвя се чернодробен хомогенат и се определя активността на алкохолдехидрогеназата в присъствието на Ca 2+ йони при концентрация 10 -4 М. 4 табл.
Изобретението се отнася до експерименталната биология и медицина, биохимията и може да се използва за определяне на активността на алкохолдехидрогеназата (ADH).
Изследването на активността на алкохолдехидрогеназата в тъканите е от голямо значение за оценка на механизмите на толерантност и характеризиране на фармакодинамиката на етанола в организма. Настоящите методи за определяне на ензимната активност не са достатъчно точни поради наличието на ADH инхибитори, което е потвърдено в проучвания. Следователно, изследователското предизвикателство е да се подобри точността на определяне на активността на ADH в тъканта без влиянието на естествените инхибитори на ензима, присъстващ в тъканта.
За прототип на изобретението е избран метод за определяне на активността на алкохолдехидрогеназата в тъканта. Ензимната активност се определя в среда със следния състав: 2,7 ml (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0). 0.1 ml (0.04 М NAD); 0.1 ml (0.75 М етанол); 0,1 ml тъканен хомогенат. Ензимната активност се изразява като nmol NADH/min на mg протеин. Този метод обаче има значителен недостатък. Не взема предвид наличието на инхибиторен ефект върху алкохолдехидрогеназата в тъканите. В резултат на това активността на ензима по време на определянето се оказва подценена, което не позволява правилно да се оценят реалните възможности на ензимната система за метаболизъм на етанол.
Техническият резултат от изобретението е да се повиши точността на определяне на активността на алкохолдехидрогеназата в тъканите.
Техническият резултат в метода за определяне на активността на ADH, включващ вземане на черен дроб, приготвяне на хомогенат, определяне в негоактивността на ензима на алкохолния метаболизъм се постига чрез факта, че определянето на активността на алкохолната дехидрогеназа се извършва в присъствието на Ca 2+ йони, за да се елиминира ефектът на инхибиторите върху ензима.
Определянето на активността на алкохолдехидрогеназата по предложения метод не е използвано досега никъде. В експеримента беше установено, че в присъствието на Ca 2+ йони ефектът на ендогенните инхибитори върху ADH се елиминира, което позволява да се определи действителната активност на ензима в тъканта.
По този начин, въз основа на експериментални изследвания върху ефекта на Ca 2+ йони върху активността на ADH, е разработен метод за определяне на активността на алкохол дехидрогеназата в тъканите. Положителният ефект от предложения метод е да повиши точността на определяне на активността на алкохолдехидрогеназата с 42%k в резултат на определяне на активността на ензима в тъканта в присъствието на Ca 2+ йони.
Предложеният метод се осъществява по следния начин. Опитното животно (плъх) се умъртвява чрез обезглавяване. Черният дроб се отстранява и се приготвя хомогенат в средата със следния състав (0.25 М захароза, Tris-HCl, рН-7.4) в съотношение 1 g тъкан + 9.0 ml от средата. Полученият хомогенат се разрежда с изолиращата среда 5 пъти и се вземат 0,1 ml за определяне на активността на ADH. Определянето на ензимната активност се извършва в среда със следния състав: 2,6 ml (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0.1 ml (0.04 М NAD); 0.1 ml (0.75 М етанол); 0,1 ml (0,001 М CaCl2); 0,1 ml хомогенат. Активността на ензима се изразява в nmol NADH/min на mg протеин, изчислена по формулата Activity където E е промяната в оптичната плътност на пробата за 1 min; V краен обем на пробата в кюветата 3.0 ml; 6.22 10 -3 коефициент на наномолекулна екстинкция на редуцирана форма на пиридинови нуклеотиди при дължина на вълната 340 nm; T време 1 min; И количеството протеин в пробата, определено по метода на Лоури,мг.
ПРИМЕР Животното (плъх, No 10, 150 g) се умъртвява чрез обезглавяване. Черният дроб се отстранява и се приготвя хомогенат в средата със следния състав (0.25 М захароза, Tris-HCl, рН 7.4) в съотношение 1 g тъкан + 9.0 ml от средата. Полученият хомогенат се разрежда с изолиращата среда 5 пъти и се вземат 0,1 ml за определяне на активността на ADH. Определянето на ензимната активност се извършва в среда със следния състав: 2,6 ml (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0.1 ml (0.04 М NAD); 0.1 ml (0.75 М етанол); 0,1 ml (0,001 М CaCl2); 0,1 ml хомогенат. Ензимната активност се изразява като nmol NADH/min на mg протеин, изчислена с помощта на формулата, описана по-горе.
Резултатите от определянето на активността на ADH са представени в таблица. 1.
Точността на определяне на активността на ADH в предложения метод е с 42% по-висока, отколкото в прототипа.
ПРИМЕР 2. Животното (плъх, № 14, 158 g) се умъртвява чрез обезглавяване. Черният дроб се отстранява и се приготвя хомогенат в средата със следния състав (0.25 М захароза, Tris-HCl, рН 7.4) в съотношение 1 g тъкан + 9.0 ml от средата. Полученият хомогенат се разрежда с изолиращата среда 5 пъти и се вземат 0,1 ml за определяне на активността на ADH. Определянето на ензимната активност се извършва в среда със следния състав: 2,6 ml (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0.1 ml (0.04 М NAD); 0.1 ml (0.75 М етанол); 0,1 ml (0,001 М CaCl2); 0,1 ml хомогенат. Ензимната активност се изразява като nmol NADH/min на mg протеин, изчислена с помощта на формулата, описана по-горе.
Резултатите от определянето на активността на ADH са представени в таблица. 2.
Точността на определяне на активността на ADH в предложения метод е с 45% по-висока, отколкото в прототипа.
ПРИМЕР 3. Животното (плъх, № 19, 140 g) се умъртвява чрез обезглавяване. Черният дроб се отстранява и се приготвя хомогенат в среда със следния състав (0,25 М захароза, Tris-HCl, рН 7,4) в съотношение 1 g тъкан + 9,0ml среда. Полученият хомогенат се разрежда с изолиращата среда 5 пъти и се вземат 0,1 ml за определяне на активността на ADH. Определянето на ензимната активност се извършва в среда със следния състав: 2,6 ml (0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 9,0); 0.1 ml (0.04 М NAD); 0.1 ml (0.75 М етанол); 0,1 ml (0,001 М CaCl2); 0,1 ml хомогенат. Ензимната активност се изразява като nmol NADH/min на mg протеин, изчислена с помощта на формулата, описана по-горе.
Резултатите от определянето на активността на ADH са представени в таблица 3.
Точността на определяне на активността на ADH в предложения метод е с 43% по-висока, отколкото в прототипа. Обобщените резултати от изследването за определяне на активността на алкохолдехидрогеназата са представени в таблица. 4.
Проучванията показват, че точността на определяне на активността на алкохолдехидрогеназата в тъканта, предложеният метод се увеличава с 42% в сравнение с прототипа.
МЕТОД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АКТИВНОСТТА НА АЛКОХОЛД ДЕХИДРОГЕНАЗАТА, включващ вземане на черен дроб, приготвяне на хомогенат, определяне на ензимната активност в инкубационна среда, характеризиращ се с това, че активността на алкохолдехидрогеназата в тъкан се определя в присъствието на калциев хлорид в концентрация 10 - 4 mol.