Метод за определяне на антитела срещу опортюнистични инфекции в цереброспиналната течност на децата

Собственици на патент RU 2488822:

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите. Предложен е метод за откриване на антитела срещу опортюнистични инфекции в цереброспиналната течност на децата. Използват се диагностичен кит за определяне на антитела в кръвта и полистиролови плаки. Цялата течност в количество от 10 μl се разрежда в съотношение 1:100. Пробата се инкубира при 37°C за 40-45 минути. Вторичната инкубация с конюгата на антитялото се провежда при 37°C-38°C за 55-60 минути. Чрез промяна на критичната стойност на оптичната плътност се определя наличието на антитела в цереброспиналната течност. Методът позволява откриване на антитела при деца в малък избран обем от CSF (10 μl) и може да се използва при диагностицирането на опортюнистични инфекции при деца. 4 табл., 3 пр.

Изобретението се отнася до медицината, по-специално до вирусологията, и може да се използва за откриване на антитела срещу опортюнистични инфекции в цереброспиналната течност на деца.

Хроничните инфекциозни заболявания при децата заемат значително място сред острите инфекциозни състояния, всички лекари, включително педиатрите, са изправени пред този проблем.

През последните години изследователи и лекари от различни специалности привлякоха вниманието на изследователи и лекари от различни специалности, тъй като се наблюдава увеличение на честотата на вътрематочните инфекции (IUI), причинени от херпесни вируси, вируси на рубеола, парвовируси В19, хламидия, микоплазми, токсоплазми, гъбички и стрептококи от групи А и В.

Причинителите на тези инфекции са способни да засегнат различни органи и системи, образувайки тежка патология. Активирането на тези инфекции при дете може да се случи в различни органи и системи. При отслабване на имунитета се активират значителни количества опортюнистични микроби, съотношението на „спящите“ и активните микроби се измества към последните и клиничната картина се задълбочава.В този момент, с правилна диагноза, лечението ще бъде най-ефективно. Познаването на характеристиките на опортюнистични инфекции помага да се избере правилната и ефективна тактика на лечение.

Съвременните диагностични методи, по-специално определянето на антитела в кръвта чрез ELISA и определянето на ДНК на патогена чрез PCR, показват, че честотата на инфекция на хората с опортюнистични инфекции достига 90-99%.

Най-важното за лекаря е определянето на антитела в централната нервна система, като основен показател за тежестта на инфекциозния процес.

Съвременните нива на лабораторна диагностика позволяват да се открият голям брой патогени или антитела към тях, отбелязвайки тяхното присъствие, но не винаги позволяват да се характеризира етиологичното значение на откритите патогени и само откриването на патоген или антитела, произведени от него в CSF, е "златен" стандарт за етиологично декодиране на заболяването.

Понастоящем има известен метод за определяне на антитела срещу опортюнистични инфекции чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ в кръвта (Таранов A.G. "Лабораторна диагностика в акушерството и гинекологията". Справочник, Москва, 2004 г.) Методът позволява, използвайки акредитирани тестови системи, откриването на имуноглобулини от класове IgM и IgG към различни вируси в човешки серум (плазма), , напълно изключва използването на CSF като обект на изследване, тъй като напр. тази тестова система е с ограничена употреба.

В настоящия метод, антитела, специфични за патогена в CSF, се откриват с помощта на подходящите тестове SERION ELISA >

Методът обаче има редица недостатъци.

1. Използването на 100 µl цяла цереброспинална течност за 1 изследване не винаги е възможно поради голямото количествоматериал, взет от деца, и използването на по-малко от 100 μl не дава резултат.

2. Използва се само за рубеола (не пълен набор от инфекции).

3. Невъзможност за определяне на имуноглобулини от клас М и А. Определя се само G, което не е етиологично значимо при остри форми на инфекции или реактивиране на инф.

4. Високата цена на вносните тестови системи, невъзможността за постоянното им придобиване (митница), следователно, неудобството по отношение на употребата.

По този начин известният метод не гарантира точността на определяне на антитела срещу опортюнистични инфекции в цереброспиналната течност на деца.

Техническият резултат от настоящото изобретение е да се подобри точността на определяне на антитела срещу опортюнистични инфекции в цереброспиналната течност на деца, чрез оценка на етиологичното значение на откритите патогени.

Този резултат се постига чрез факта, че при известния метод, включващ образуването на комплекс антиген-антитяло върху твърдата фаза на полистиролови ензимни имуноанализни плаки, използването на диагностични комплекти за откриване на антитела в кръвта, съгласно изобретението, цялата цереброспинална течност в количество от 10 μl се разрежда в съотношение 1:100, пробата се инкубира при 37°C за 40-45 min. , вторичната инкубация с конюгата се извършва при 37°C-38°C за 55-60 min и чрез промяна на критичната стойност на оптичната плътност се определя наличието на антитела в CSF.

Новото е, че за разлика от прототипа, където е възможно изследване само за рубеола, използването на стандартни тест системи включва увеличаване на обхвата на изследванията на CSF за всички известни патогени, определени от тест системите, налични в арсенала на лабораторията.

Предложеният метод се осъществява по следния начин. Пациентът взема проба от тестовия материал (10 µl)цереброспинална течност (CSF). В случай на невроинфекция с неясна етиология, диагностиката включва няколко комплекта тестови системи Vector-Best, предназначени за диагностициране на антитела в човешки серум (плазма) чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ. Едновременно с това изследването диагностицира имуноглобулини от класове IgM и IgG за вирус на херпес симплекс тип 1 и 2, цитомегаловирус, вирус на Епщайн-Бар, вирус на рубеола, вирус на кърлежов енцефалит, токсоплазмоза и др.

Специфичните антитела към патогена в CSF (CSF) се откриват с помощта на подходящи тестове - комплекти реагенти и, следвайки инструкциите към комплекта (за серум) в диагностиката на CSF, предлагаме да изберете други параметри за настройка на експеримента: 1) Предварително разреждане на CSF 1:10 (10 µl CSF на 100 µl буфер за разреждане). Смесете добре разредените проби.

2) Добавете контролни проби -1 ямка - 100 µl K (+)

- 2 ямки - 100 µl K (-) -.

В останалите ямки добавете 90 µl разтвор за разреждане на серума и 10 µl предварително разредена цереброспинална течност - разбъркайте старателно. Въвеждането на пробите трябва да се извърши бързо, в рамките на период от време не повече от 10 минути.

3) Затворете плаката с филм и инкубирайте в термостат за 40-45 минути при температура 37°C.

4) В края на инкубацията отстранете адхезивния филм и с помощта на устройство за измиване измийте ямките на плаката 5 пъти с разтвора за измиване. В края на измиването внимателно отстранете останалата влага от ямките, като потупате обърнатата плоча върху филтърната хартия.

5) Добавете 100 µl конюгат към всички ямки. Плаката се запечатва с филм и се инкубира в термостат за 55-60 минути при температура 37°C.

6) В края на втората инкубация отстранетесъдържанието на ямките и измийте плаката 5 пъти с промивен разтвор. Изсушете плочите чрез потупване върху филтърна хартия.

7) Добавете 100 µl разтвор на ТМВ към всички ямки и инкубирайте на защитено от светлина място за 25 минути при температура 18°C-25°C.

8) Разпределете 100 µl стоп реагент във всички ямки.

Измерете оптичната плътност на разтворите в ямките на лентите на спектрофотометър с вертикално сканиране в двувълнов режим: при основна дължина на вълната 450 nm и референтна дължина на вълната в диапазона 620-655 nm.

Вирусологичната лаборатория изследва 98 кръвни серума и цереброспинална течност на пациенти с различни невропатологии в клиниката на NIIDI. Изследванията са проведени с използване на цяла цереброспинална течност, взета в обем от 10 μl и разредена в съотношение 1:100, последвано от инкубиране при 37°C за 45 минути с вторична инкубация при 37°C за 55-60 минути.

Пациент L.Yu. 17 г. с диагноза множествена склероза № b/l 2843. При вирусологично изследване на биологичен материал на пациента, взет в обем от 10 μl (метод ELISA), са получени следните резултати:

Херпес 1	Херпес 1	CMV	CMV	Херпес 2	Херпес 6
антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кръв	0	0	0	0	0	-
2 кръв	0	0	1,057	0	0	-
алкохол	0	0	1,145	0	0	1300
* Цифровото ниво на антителата е посочено в единици оптична плътност

В клиниката на NIIDI в отделението по невроинфекции имашепациент С.А. 15 г. с диагноза вирусна инфекция с неустановена етиология № б/л 3189.

По време на вирусологичното изследване на биологичния материал на пациента (метод ELISA) са получени следните резултати:

Херпес 1	Херпес 1	CMV	CMV	Херпес 2	Херпес 6
антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кръв	0	2,419	0	0	0	0
2 кръв	0	2,236	0	0	0	0
алкохол	0	0,317	0	0	0	0
* Цифровото ниво на антителата е посочено в единици оптична плътност

Лабораторна диагноза: херпес тип 1 с проникване на вируса в централната нервна система.

Методът позволява да се установи проникването на антитела срещу херпес тип 1 в централната нервна система и дава възможност да се предскаже тежестта на инфекциозния процес.

Пациент Р.Д. 7 години с диагноза серозен менингит с неизвестна етиология.

Херпес 1	Херпес 1	CMV	CMV	Херпес 2	Херпес 6
антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кръв	0	0	0	0	0	0,496
2 кръв	0	0	0	0	0,469
алкохол	0	0	0	0	0	0,507
* Цифровото ниво на антителата е посочено в единици оптична плътност

лабораториядиагноза: серозен менингит, етиологично свързан с херпесен вирус тип 6, който е невротропен вирус и потвърден с нашия метод.

Сравнителна таблица за използването на прототипа на тестовата система (тестова система Serion Elisa >

Нозологична форма	Ликьор в обем от 100 µl	Ликьор в обем от 10 µl
Рубеола (прототип)	+*	-
Рубеола (предложен метод)	+	+
CMV (прототип)	-	-
CMV (предложен метод)	+	+
Херпес тип 6 (прототип)	-	-
Херпес тип 6 (предложен метод)	+	+
Херпес тип 2 (прототип)	-	-
Херпес тип 2 (предложен метод)	+	+
• Открити са антитела от клас IgG

Метод за определяне на антитела срещу опортюнистични инфекции в гръбначно-мозъчната течност на деца, който включва образуването на комплекс антиген-антитяло върху твърда фаза на полистиролови ензимни имуноанализни плаки, като се използват диагностични комплекти за откриване на антитела в кръвта, характеризиращ се с това, че цялата цереброспинална течност в количество 10 μl се разрежда в съотношение 1:100, пробата се инкубира при 3°С. 7 ° С за 40-45 минути, вторична инкубация с конюгата се извършва при 37 -38 ° С за 55-60 минути и промяната в критичната стойност на оптичната плътност определя наличието на антитела в цереброспиналната течност.