Метод за получаване на полихемоглобин с повишена ефективност на кислородния транспорт - RF патент
Методът включва взаимодействие на дезоксихемоглобин с бифункционален омрежващ агент в буферен разтвор с рН 6,8 - 7,4 при моларно съотношение хемоглобин : омрежващ агент = 1 : (4 - 24). Реакцията завършва чрез добавяне на вещество, което затваря останалите функционални групи на омрежващия агент. Като омрежващ агент се използва глутаралдехид, модифициран с вещество от серия, съдържаща дикарбоксилна аминокиселина (например аспарагинова киселина, глутамин) и натриев бисулфит. Модификацията се извършва чрез взаимодействие на 0,1 - 5,0 тегл. % разтвори на глутаралдехид и модификатор и при тяхното моларно съотношение 1:0,2 - 1,2. Методът позволява да се модифицира не оригиналният хемоглобин, както се прави с всички известни методи, а омрежващият агент - глутаралдехид. 1 z.p.f-ly, 3 табл.
Чертежи към патент България 2132687
Изобретението се отнася до производството на полихемоглобин, който може да представлява основата на кръвозаместващи разтвори с функция за пренос на кислород.
Изобретението може да се използва за получаване на кръвозаместващи разтвори, сравними по ефективност на транспортиране на газ (по отношение на пренос на кислород) с човешки еритроцити.
Известен е метод за получаване на полихемоглобин с повишена ефективност на кислородния транспорт /1/, който се осъществява чрез следната съвкупност от съществени признаци: I етап.
1. Модификация на хемоглобина (GB). 0.2 тегл.% глюкоза, 0.2 тегл.% глутатион и 0.05 тегл.% аскорбинова киселина се добавят към 18 тегл.% разтвор на Gb от донорска кръв в 0.1 М Tris буфер с рН 7.4.
2. След това към разтвора се добавя пиридоксал-5-фосфат (PP) в моларно съотношение PP:Gb = 4 : 1.
3. Разтворът се деоксигенира чрез продухванеазот и се добавя натриев борохидрид.
4. Полимеризация. Към воден буферен разтвор, съдържащ 16 тегл.% Hb, модифициран с пиридоксал-5-фосфат, добавете 0,15 тегл.% глутатион и 0,29 тегл.% лизин.
5. Разтворът се охлажда до +5 o C и при тази температура се добавя 10 - 15 тегл.% воден разтвор на глутаралдехид (GA) с разбъркване, масовото съотношение на GA : Gb = 1: 4 - 5.
6. Реакцията се прекратява чрез добавяне на воден разтвор на лизин.
Основната характеристика на получения модифициран полихемоглобин (PHb) е неговото кислородно полунасищане (P50), което се сравнява с P50 за оригиналния Hb.
В табл. 1 (вижте в края на описанието) дава сравнителни стойности на P50 за модифициран PHb и оригинален GB, получени при известни условия.
Основният недостатък на известния метод е използването на скъп биологично активен реагент, пиридоксал-5-фосфат, за модифициране на GB. PF се въвежда в реакционната смес в излишни количества и след това се отстранява от целевия продукт, тъй като свободният PF може да прояви нежелани ефекти.
Целта на изобретението е да се създаде метод за производство на PHB с повишена ефективност на транспортиране на кислород, като се използва по-технологичен модификатор, който няма значителна биологична активност. Този проблем е решен чрез заявения метод за получаване на полихемоглобин с повишена ефективност на кислородния транспорт, който се осъществява чрез комбинация от следните съществени характеристики: I етап.
1. Модифициране на глутаралдехид. НА се модифицира чрез действието на модификатор във воден буферен разтвор при рН 6,8 - 7,4 и при концентрации на НА и модификатора от 0,1 - 5,0 тегл.%, моларното съотношение НА : модификатор = 1 : 0,2 - 1,2.
2. Като модификатор се взема вещество от серия, включваща дикарбоксилни аминокиселини (например аспарагинова киселина, глутамин) и натриев бисулфит.
3. Полимеризация. 1 - 10 тегл.% воден разтвор на GB от донорска кръв се деоксигенира и при 4 o - 24 o C се добавя 1 - 5 тегл.% воден разтвор на модифициран глутаралдехид при моларно съотношение GB : свързан модифициращ агент = 1: 4 - 24.
4. Реакцията се прекратява чрез добавяне на воден разтвор на натриев борохидрид.
В изолирания целеви продукт, MWD (разпределение на молекулното тегло) се определя чрез гел проникваща хроматография и SMM се оценява, а стойността на Р50 се определя от кривите на дисоциация на оксихемоглобина.
Отличителни от характеристиките на прототипния метод са характеристиките от 1 до 3.
Анализът на предшестващото състояние на техниката не ни позволи да намерим решение, което напълно съвпада по отношение на съществените характеристики с заявения метод. Това потвърждава новостта на предложението.
Анализът на известното състояние на науката и технологиите не ни позволи да намерим решения, които използват горните отличителни характеристики. Новостта на отличителните характеристики показва наличието на първата открита функционална връзка "структура - свойство", което потвърждава съответствието на решението с условието за патентоспособност "изобретателско ниво". Наистина, всички известни досега методи за получаване на PHb с повишена ефективност на транспортиране на кислород се основават на модификацията на оригиналния HF. В заявения метод ефектът се постига чрез модифициране на омрежващия агент - глутаралдехид.
Според каталога на реактивите "Sigma", Chemical Company, 1994 г., "Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic reagents" /5/ 1 g пирпидоксал-5-форсфат струва 12,1 щатски долара, 500 gглутаминова киселина (99% чистота) - $11.
Хемоглобинът се получава чрез осмотична хемолиза на измити еритроцити от донорска кръв /6/. Концентрацията на нативния Hb и продуктите от химичната му модификация се определя спектрофотометрично чрез продукцията на цианметхемоглобин при дължина на вълната = 540 nm /7/. Използва се 25% воден разтвор на глутаралдехид от Reanal (Унгария), пречистен с активен въглен. Концентрацията на НА се определя чрез диференциална рН-метрия с хидроксиламин /8/. Натриев бисулфит (NaHSO3) се получава непосредствено преди употреба /9/. Концентрацията му се определя йодометрично. Концентрацията на аминокиселините се определя чрез реакция с 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина /10/.
Кривите на дисоциация на оксихемоглобина бяха получени на инструмент Hem-O-xan (Amico, САЩ) при стандартни условия (рН 7,4; 37°C) в диапазона на парциалните налягания на кислорода от 0 до 180 Torr, постигнати чрез продухване на азот или смес азот-кислород (75:25 v/v) без добавяне на CO2. Въз основа на кривите на дисоциация на оксихемоглобина се определя полунасищането на GB с кислород (Р50). Всички проби от Hb и модифициран PHb се диализират срещу 0,05 М Tris-HCl буфер с 0,15 М NaCl, рН 7,4. Грешката при определяне на P50 е 10 - 15%. Разсейването на данните за P50 зависи преди всичко от пълнотата на отстраняване на 2,3-дифосфоглицерат от разтвора на първоначалния Hb, времето на съхранение на Hb, степента на неговото автоокисление (съдържанието на метформа), а също така отразява статистическия характер на процеса на модификация на молекулата на Hb при нейното омрежване. Във всеки случай стойността P50 на целевия GB се сравнява със стойността P50 на оригиналния GB.
За да потвърдим съответствието на заявения метод с условието за "промишлена приложимост" и за по-добро разбиране на същността на предложението, представямепримери за конкретно изпълнение на изобретението.
Пример 1. Получаване на модифициран PHB при условията на прототипния метод: модификация на GB с пиридоксал-5-фосфат и омрежване с глутаралдехид.
20 ml от 5 тегл.% воден разтвор на Hb от донорска кръв с рН 7,0 се продухва с азот при 10 o C до преминаването на Hb в дезокси форма. След това, докато разтворът се разбърква в поток от азот, се добавят 1.6 ml от 1 тегл.% воден разтвор на пиридоксал-5-фосфат в 0.1 М трисбуфер рН 7.0. След разбъркване в продължение на 1 час при 10°С се добавят 0,25 ml от 0,1% тегловни воден разтвор на натриев борохидрид, рН 8,0. Към воден разтвор на модифицирания GB при 10 o C в поток от азот се добавят 2,5 ml воден 2 тегл.% разтвор на глутаралдехид. Реакцията се провежда в продължение на 1 час и завършва чрез въвеждане в реакционната смес на 1 ml 0,1 тегл.% разтвор на натриев борохидрид с рН 8,0.
Полученият пиридоксилиран PHb се изолира чрез гел хроматография. GB добив 100%. Съдържанието на пиридоксал-5-фосфатни групи и други характеристики са представени в табл. 2 (виж в края на описанието) Примери 1 до 5 бяха проведени при идентични условия.
Пример 6. Получаване на PHb чрез омрежване на GB с глутаралдехид, модифициран с глутаминова киселина.
40 ml воден разтвор на GB от донорска кръв с концентрация 5,0 тегл.% с рН 7,0 се поставя в колба от 200 ml и се деоксигенира в поток от азот с разбъркване при 12 o C. 3,1 ml воден разтвор с концентрация 2 тегл.% за GA и 1,47 тегл.% за глутаминова киселина в 0,1 М се добавя на капки към разтвор на деоксигениран GB фосфатен буферен разтвор рН 7.0. Реакцията се провежда при разбъркване в продължение на 1 час, след което се добавят 52,4 ml 1 тегл.% воден разтвор на натриев борохидрид с рН 9,0. Бъркайте още 30 мин. Взема се 1 ml от реакционната смес, провежда се диализа срещу 2 l 0,05 МTris буферен разтвор рН 7,4, съдържащ 0,15 М NaCl през деня. В така подготвената проба се измерва кривата на дисоциация на оксихемоглобина. За сравнение, кривата на дисоциация на оксихемоглобина се измерва в първоначалния разтвор на Hb, диализиран при същите условия. За целевия продукт P50 23 Torr, за оригиналния GB 15 Torr. MM ( ) за целевия продукт е 2,3 10 5 D.
Примери 7 - 11, изпълнени при условията на пример № 6, всички данни за примери 6 - 11 са представени в табл. 3 (виж в края на описанието).
Пример 12. Получаване на PHb чрез омрежване на GB с глутаралдехид, модифициран с натриев бисулфит.
В колба от 51 ml се добавят 10 ml воден разтвор на Hb с концентрация 4,7 тегл. % с рН 7,0 и извършва деоксигениране на GB чрез продухване на азот при 12 o C. Към разтвор на деоксигениран GB при същата температура и при разбъркване се добавят 0,84 ml физиологичен разтвор с концентрация 1,74 тегл.% за НА и 0,73 тегл.% за натриев бисулфит. Сместа се разбърква в продължение на 1 час. Реакцията се спира чрез добавяне на 0.5 ml от 1.0 тегл.% воден разтвор на натриев борид при рН 8.5, последвано от разбъркване в продължение на 30 минути. При условията на пример 1 целевият продукт се изолира и характеризира.
Примери 13 и 14 се изпълняват при условията на пример 12. Всички данни за примери 12 - 14 са представени в таблица 3.
Анализът на представените примери показва, че задачата е решена. Получава се модифициран PHB със запазване на разтворимостта във вода и висока ефективност на транспортиране на кислород. В този случай модификацията се извършва не върху оригиналния GB, както се прави по всички известни методи, а върху омрежващия агент - глутаралдехид. Като модификатори се използват значително по-технологични вещества от серия, включваща дикарбоксилни аминокиселини и бисулфит.натрий.
Същността на заявеното изобретение не се ограничава до дадените примери със специфични дикарбоксилни аминокиселини и натриев бисулфат като модификатори. Може да се очаква, че други дикарбоксилни аминокиселини, както и ди- и поликарбоксилни пептиди, също ще бъдат ефективни, когато се използват като модификатори за омрежващи агенти.
Може да се посочи, че допълнително предимство на претендирания метод е увеличен ефект на модификация: в таблица 3 е показано, че съотношението P50 PHb / P50 Gb е 1,35 - 2,25, а в таблица 2 същите съотношения за PHb, получени при условията на прототипния метод, не надвишават 1,07 - 1,55.
Източници на информация 1. L. R. Sehgal, A. L. Rosen, S. A. Gould, H. L. Sehgal, G.S. Мос/Преливане. - 1983. - с. 23. - N 2. - С. 158-162.
2. F. De-Venuto / Биоматериали, изкуствени клетки и изкуствен орган. - 1988. - с. 16. - N 1-3. - С. 77-83.
3.L.R. Сегал, Х.Л. Sehgal, A.L. Росен, С.А. Гулд, Р. Де-Уоскин, Г.С. Мос/пак там. - С. 173-183.
4.P.E. Keipert, T.M. Chang/пак там. - С. 185-196.
5. Биохимични органични съединения за изследвания и диагностични реагенти, Sigma, Chem. Компания, 1994 г.
6.S.E. Rabiner / J. Exp. Med. - 1967 г. - с. 126. - N 6. - С. 1127-1132.
7. М. С. Кушаковски / Клинични форми на увреждане на хемоглобина. Л.: Медицина. - 1968. - С. 23.
8. Х. Р. Роу, Г. Мичъл / Аналит. Chem. - 1951 г. - с. 23. - N 12. - P. 1758-1760.
9. Ю. В. Карякин, И.И. Ангелов / Чисти химични реактиви, М.: ГНТИ, хим. л-ра. - 1955. - С. 397-398.
10. R. Fields / Biochem. Й. - 1971. - с. 124. - С. 581-590.
11. Н.П. Кузнецова, Г.В. Самсонов / Високомолек. връзки. - 1985. - сер. А. - т. 27. - N 12. - С. 2611 - 2614.
ФОРМУЛАИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Метод за получаване на полихемоглобин с повишена ефективност на транспортиране на кислород чрез взаимодействие на деоксигениран хемоглобин с глутаралдехид в буферен разтвор с предварителна модификация на един от взаимодействащите компоненти и завършване на реакцията чрез добавяне на вещество, което затваря функционалните групи на омрежващия агент, характеризиращ се с това, че глутаралдехидът се модифицира в буферен разтвор при рН 6,8 - 7,4 при концентрация на алдехид и модификатор ier от 0,1 - 5,0 тегл.% и при mol ярко съотношение на глутаралдехид : модификатор, равно на 1: (0,2 - 1,2), и взаимодействието на деоксигениран хемоглобин с модифициран глутаралдехид се извършва при моларно съотношение на хемоглобин : свързан модифициращ агент 1: (5 - 24).
2. Методът съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че като модификатор се използва вещество от серия, включваща дикарбоксилна аминокиселина (например аспарагинова киселина, глутамин) и натриев бисулфит.