Методи за определяне на общия кръвен протеин - Студопедия
Методите за определяне на общия протеин в кръвния серум се основават на различни принципи:
- спектрофотометричен - за определяне на абсорбцията при 280 nm,
- фотометрични - за измерване на оцветени реакционни продукти,
- рефрактометрични - за определяне на коефициентите на пречупване или пречупване на светлината.
Най-често срещаните са рефрактометрични и фотометрични биуретни методи. При биуретната реакция медният атом свързва азотните атоми на протеина, за да образува оцветени съединения.
Принципът на метода : пептидните връзки на протеина с медни соли в алкална среда образуват виолетов комплекс (биуретова реакция).
Реагенти :
1. Натриев хлорид: 9 g в 1 литър. вода.
2. Сода каустик: 8 г на 1 литър вода.
3. Калиев йодид: 30 mmol/l разтвор на калиев йодид в 0,2 mol/l разтвор на натриев хидроксид; 0,5 g калиев йодид се поставя в мерителна колба от 100 ml, нагласена до 0,2 mol/l с разтвор на натриев хидроксид.
4. Калиево-натриев тартарат 4-вода (Рошелска сол).
5. Меден сулфат 5 вода.
6. Биуретов реактив: 4,5 g сол на Rochelle се разтварят в 40 ml 0,2 mol/l разтвор на натриев хидроксид, добавят се 1,5 g меден сулфат и 0,5 g калиев йодид и се разтварят. Допълнете до 100 ml с 0,2 mol/l разтвор на натриев хидроксид. Реагентът е стабилен, когато се съхранява в тъмен стъклен съд.
7. Работен разтвор на биуретов реактив: 20 ml биуретов реактив се смесват с 80 ml 0,5% разтвор на калиев йодид. Разтворът е стабилен.
8. Разтвор за калибриране на албумин: 100 g/l разтвор на албумин в 154 mmol/l разтвор на натриев хлорид.
Ход на определяне: Експериментален тест: 5 ml от работния разтвор на биуретовия реагент се добавят към 0,1 ml кръвен серум и се смесват. След 30 минути измеретефотометър в кювета с дебелина на слоя 1 cm при дължина на вълната 500-560 nm, (филтър за зелена светлина) срещу празна проба. Празна проба: 0,1 ml от 154 mmol/l разтвор на натриев хлорид се добавя към 5 ml от работния биуретов реактив, след което се обработва като експериментална проба. Изчислението се извършва съгласно графика за калибриране.
Изграждане на калибровъчна графика: разрежданията се приготвят от 10% разтвор на албумин за калибриране. Вземете 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,0 ml се довеждат с разтвор на натриев хлорид, съответно всеки до 1 ml. Концентрацията в първата епруветка е 20 g/l албумин, във втората - 40 g/l, в третата - 30 g/l, в четвъртата - 80 g/l, в петата - 100 g/l. От всяко разреждане се вземат 0,1 ml от работния разтвор и се добавят 5 ml от работния биуретов реактив; след 30-60 минути те се измерват на фотометър, както в експеримента, срещу празна проба. Въз основа на получените данни се изгражда графика за калибриране.
Нормални стойности: 65-85 g/l (6,5-8,5 g/100 ml).
Не намерихте това, което търсихте? Използвайте търсачката:
Деактивирайте adBlock! и опреснете страницата (F5)наистина е необходимо