Определяне на HLA антигени на реципиента - Справка - д-р Комаровски
a. Основният серологичен метод за типизиране на HLA антигени е лимфоцитотоксичният тест. Методът е както следва: 1) 2000 изследвани лимфоцити се добавят към серуми срещу различни HLA антигени; 2) след инкубацията се добавя комплемент (за негов източник може да служи заешки серум); 3) лимфоцитите, носещи антигена, срещу който е насочен серумът, се унищожават под действието на комплемента; 4) след това към лимфоцитите се добавя багрило, което оцветява само живите клетки. Резултатът се оценява по относителния брой мъртви лимфоцити. Рязко положителен резултат показва, че лимфоцитите носят тестовия антиген.
b. Недостатъци на серологичните методи за типизиране на HLA антигени. За типизиране на антигени от клас I са необходими най-малко 15 ml кръв, а за типизиране на антигени от клас II - най-малко 30 ml кръв. Жизнеспособността на изолираните лимфоцити трябва да бъде най-малко 80%. Замърсяването, продължителното и неправилно съхранение водят до намаляване на качеството на серума и комплемента, използвани за изследване. Получаването на диагностични серуми е трудоемък и скъп процес. То се свежда до изследване на голям брой серумни проби от многораждали жени, като се използват панели от лимфоцити, типизирани за HLA антигени. Особено трудно е да се получат серуми за редки HLA антигени. При оценката на резултатите от серологичното типизиране на HLA антигените е необходимо да се вземе предвид коя лаборатория го е извършила и какво е качеството на използваните серуми. Най-малко наличните серуми за HLA клас II антигени, особено за HLA-DP антигени.
2. Молекулярно-генетични методи. Тези методи се основават на изследване на ДНК. Те са лишени от основните недостатъци на серологичните методи.Генетичното типизиране стана възможно след дешифриране на нуклеотидната последователност на HLA гените и идентифициране на разликите между различните алели на тези гени. Понастоящем молекулярно-генетичните методи се използват само за типизиране на HLA клас II гени.
b. Определянето на специфични олигонуклеотидни последователности е лишено от недостатъците на метода, описан по-горе. Алелите на HLA гените понякога се различават един от друг само с една двойка нуклеотиди. Синтезирани са едноверижни олигонуклеотидни проби, състоящи се от 19-24 нуклеотида, напълно комплементарни на уникалните последователности на всеки известен алел на HLA гена. Създадени са също сонди, които са комплементарни на последователности, общи за няколко алела. По този начин, серия от сонди с различни специфичности могат да бъдат използвани последователно за определяне на неизвестен алел. За хибридизация с олигонуклеотидни проби могат да се използват както рестрикционни ДНК фрагменти, получени с помощта на ендонуклеази, така и ДНК фрагменти, получени с помощта на PCR.
c. PCR е метод, предназначен за получаване на голям брой копия на ДНК фрагменти със специфична нуклеотидна последователност. Основното предимство на метода е неговата висока чувствителност, позволява ви да създавате много копия на ДНК фрагмент с минимално първоначално количество. За извършване на PCR е необходимо да се синтезират два олигонуклеотида, които са комплементарни на 5'-терминалните участъци на веригите на изследвания ДНК фрагмент. Реакцията включва следните етапи: 1) денатурация на ДНК за получаване на два едноверижни фрагмента; 2) хибридизация на олигонуклеотиди с 5'-терминални участъци на тези фрагменти; 3) синтез на комплементарна нуклеотидна последователност. Реакцията се провежда циклично, като последователно се повтарят всички нейни етапи до достигане на достатъчноброя на копията на оригиналния ДНК фрагмент. Броят на ДНК копията нараства експоненциално и след 20-ия цикъл на реакцията се увеличава с повече от 1 000 000 пъти. Получените копия се изследват с помощта на набор от олигонуклеотидни проби. Хибридизацията на пробата, която кодира последователността на известен алел на HLA гена, с изследвания ДНК фрагмент показва, че геномът на изследвания съдържа този алел. Ако не настъпи хибридизация, алелът отсъства. Липсата на хибридизация с всички олигонуклеотидни проби не служи като доказателство за откриването на нов алел, тъй като може да се дължи на непълнотата на използвания набор от проби. Разработва се молекулярно-генетично типизиране на HLA гени от клас I. Високата точност и специфичност на PCR позволява успешното използване на този метод в други области на медицината, например в съдебната медицина. Разработват се и други молекулярно-генетични методи за HLA типизиране.
3. Клетъчни методи. След разпознаване на чужд антиген започва пролиферацията на Т-лимфоцитите. Този процес може да бъде възпроизведен in vitro в смесена лимфоцитна култура, състояща се от донорни и реципиентни лимфоцити. Ако донорът и реципиентът носят различни HLA антигени от клас II, смесената култура ще пролиферира. За да се оцени имунният отговор на лимфоцитите само от една от изследваните клетки (респондерни клетки), лимфоцитите на другата (стимулиращи клетки) се инактивират чрез облъчване или митомицин. Смесената култура на лимфоцити прави възможно откриването на разлики в HLA антигените, които не могат да бъдат открити чрез серологични методи, като разлики в HLA-DP и HLA-DQ антигени.
a. Смесена култура от лимфоцити. Равен брой донорни и реципиентни лимфоцити се смесват и се инкубират в продължение на 5 дни притемпература от 37°C, след това добавете 3Н-тимидин, който е интегриран в ДНК на пролифериращи клетки. В присъствието на 3Н-тимидин, лимфоцитите се инкубират още 1 ден, след което се определя радиоактивността на реагиращите клетки. Култури, състоящи се само от реагиращи клетки, се използват като отрицателна контрола, а култура от реагиращи клетки, стимулирани със смес от лимфоцити от различни донори, се използва като положителна контрола. Ако радиоактивността в смесената култура надвишава радиоактивността в отрицателната контрола с не повече от 20% или е по-малко от 20% от радиоактивността в положителната контрола, донорът и реципиентът се считат за съвместими с HLA клас II.
b. За едновременно определяне на 3 HLA клас II антигена (HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR) с помощта на смесена лимфоцитна култура, като стимулиращи клетки се използват лимфоцити, носещи известни HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR антигени от хомозиготни донори. Обикновено тези донори са родени от тясно свързани бракове. Ако хомозиготните стимулиращи клетки не причиняват пролиферация на респонденти в смесена лимфоцитна култура, тогава респондентите носят същите HLA клас II антигени. По този начин смесената култура на лимфоцити позволява да се оцени съвместимостта на донора и реципиента без анализ на HLA антигени (използвайки стимулиращи клетки с неизвестен фенотип) и едновременно определяне на 3 HLA клас II антигена (използвайки хомозиготни стимулиращи клетки).
g. Основният недостатък на методите, базирани на използването на смесена култура от лимфоцити, е голяма инвестиция във времето (около седмица). За по-бързи резултати, отговарящите клетки в смесената лимфоцитна култура са предварително активирани с известни HLA клас II антигени. За това е необходимопанел от лимфоцити с различни HLA клас II антигени. В допълнение, методите, базирани на използването на смесена култура от лимфоцити, са слабо възпроизводими, следователно, ако е необходимо да се избере един от няколко донора, се приготвят смесени култури с лимфоцити, получени от всички донори едновременно. Ако се използват хомозиготни стимулиращи клетки, те трябва да бъдат изолирани непосредствено преди тестването. Вече беше отбелязано, че има много малко донори на хомозиготни клетки, така че изследванията, използващи тези клетки, се извършват само в специализирани лаборатории. Използвайки реакцията на клетъчна цитотоксичност, отхвърлянето на трансплантанта не може да бъде предвидено във всички случаи, така че методът не се използва широко.
Източник: G. Lawlor, Jr., T. Fisher, D. Adelman "Клинична имунология и алергология" (превод от английски), Москва, "Практика", 2000 г.