Определяне на протеин по метода на Kjeldahl
Един от най-важните показатели за качеството на продукта, който определя неговата хранителна стойност, е съдържанието на протеини. Класическият начин за определяне на протеина е метод, разработен през 1883 г. от датския химик Йохан Келдал, който по-късно е кръстен на него. Това е много времеемък и дълъг анализ, поради което в съвременната лабораторна практика методът на Kjeldahl често се опитва да бъде заменен с алтернативни методи за определяне на протеини, включително използването на скъп софтуер и хардуерни системи. Но методът на Kjeldahl, въпреки своята сложност, все още остава единственият общоприет арбитражен метод за определяне на протеини и най-често се използва като еталон за калибриране и регулиране на други методи за анализ на суровини и готови продукти.
Защо методът на Kjeldahl, въпреки повече от 120 години история, все още не е намерил достойна алтернатива? Причината за това е високата специфичност на избраната реакция на окисление на протеина със сярна киселина, в резултат на което се разрушават пептидните връзки в неговата молекула и се образуват амониеви йони, които впоследствие лесно могат да бъдат анализирани със стандартни методи. Въпреки това, възпроизводимостта и точността на метода на Kjeldahl до голяма степен зависи от опита на анализатора. В стремежа си да минимизират влиянието на човешката грешка върху резултатите от анализа, да ускорят процедурата и да повишат нейната безопасност, водещите производители на аналитично оборудване са разработили специализирани комплекти за анализ по метода на Kjeldahl. Методът включва няколко основни стъпки: вземане на проби и подготовка на пробите, мокро опепеляване, парна дестилация и определяне на концентрацията на амоний (фотометрично или титриметрично). Всеки етап има свои собствени хардуерни решения,които вече фактически се превърнаха в стандарт де факто и почти напълно замениха действията, извършвани от лаборанта ръчно.
Етап 2. Мокро опепеляване. Най-трудоемката и трудоемка стъпка в метода на Kjeldahl е етапът на мокро опепеляване, което води до пълно "изгаряне" на пробата в сярна киселина. Въпреки това е непрактично да се използва чиста сярна киселина за опепеляване поради ниската скорост на процеса. Скоростта на опепеляване и разрушаване на пробата зависи не само от свойствата на киселината, но и от температурата на обработка. Колкото по-висока е температурата, толкова по-малко време е необходимо за разлагане. Когато се използва чиста сярна киселина, температурата на опепеляване е ограничена главно от нейната точка на кипене (338°C), докато за пълното разлагане са необходими по-високи температури. Скоростта на мокро опепеляване може значително да се увеличи чрез добавяне на соли и катализатори. В класическия апарат на Kjeldahl обикновено са необходими 25 ml киселина за всеки грам проба и няколко часа, за да се извърши смилането. Основният оперативен проблем за този етап на анализ е отделянето на голямо количество токсични изпарения от серен диоксид и серен триоксид.
Етап 3. Стрипинг с пара. Бистрият разтвор, получен след етапа на разлагане, не е подходящ за директно определяне на амониев азот в него поради високото съдържание на смущаващи компоненти. За да се отдели амониевият азот, той се превръща в амонячна форма (чрез добавяне на алкали) и се дестилира с пара в специални устройства, наречени дестилатори.
В рамките на тази статия съвсем съзнателно не бяха разгледани други методи за определяне на протеина, тъй като всички те са вторични и изискват калибриране по метода на Kjeldahl. Въпреки очевидната сложност на комплекса от оборудване за определяне на протеин чрезKjeldahl, използването на този конкретен метод за анализ гарантира надеждността на резултатите, докато предложеното инструментално решение може значително да увеличи възпроизводимостта, да намали консумацията на реагенти и да гарантира безопасността на персонала. Специалисти на Федералната държавна бюджетна институция TsNPVRL извършват определянето на протеини по метода на Kjeldahl в храни и фуражи с помощта на автоматична единица за разлагане KJELDATHERM GERHARDT и автоматична установка за парна дестилация VAPODEST-20 GERHARDT.