Основи на имунохистохимичните изследвания

Имунохистоцитохимията е метод за идентифициране и определяне на локализацията в клетката и тъканите на различни структури, които имат антигенни свойства, въз основа на реакцията антиген-антитяло. Имунохистоцитохимията е високотехнологично методологично допълнение към традиционните хистологични методи на изследване в клиничната диагностика. Тъй като вече са налични голям брой поли- и моноклонални антитела с висока специфичност и авидност, броят на приложенията, за които могат да се използват IHC методите, стана почти неограничен.

Тези методи се използват широко за:

  • диференциална диагноза на тумори, определяне на източника на метастази с неясен туморен фокус, оценка на хормоналния статус на тумора, имунофенотипизиране на тумори, например тумори на лимфоидната система, определяне на прогностични фактори за туморния процес;
  • идентифициране на различни микроорганизми (бактерии, вируси);
  • определяне на хормони и техните рецептори и др.

Принцип на метода

Основата на IHC метода е имунологичната реакция на антиген и антитяло. IHC методите позволяват локализиране и идентифициране на клетъчни и тъканни антигени въз основа на тяхното свързване с антитела.

Използването на антитела е в основата на изследването на различни молекулярни образувания: • структурни компоненти на клетката; • рецептори на клетъчната повърхност; • клетъчни продукти (хормони, ензими, имуноглобулини).

Използват се редица етикети за визуализиране на мястото на свързване на антиген-антитяло: • флуоресцентни багрила; • ензимни етикети; • метали; • металопротеини; • радиоизотопи.

Моноклоналните антитела се произвеждат чрез хибридомна технология. Въпреки факта, че тяхното производство е многоетапно и сложно, те са високоспецифични и силно активни антитела и са насочени към един антигенен епитоп.

Поликлоналните антисеруми, получени чрез имунизация на животни, съдържат антитела към различни епитопи на антигена (AG). За да се получи поликлонален антисерум, пречистен антиген се прилага на лабораторно животно заедно с неспецифичен стимулатор на имунния отговор - адювант. AG стимулира много В-лимфоцити, всеки от които поражда клонинг на плазмени клетки, които произвеждат AT. AG може да има няколко епитопа и антисерумът съдържа имуноглобулини срещу всеки от тях и всеки клон на плазмени клетки е в състояние да произвежда антитела само към един тип епитоп.

Първично концентрираните антитела се разреждат до работна концентрация с помощта на разтвор за разреждане (разредител на антитела). Максималните граници на разреждане за всяко антитяло се препоръчват от производителя. Системата за изображения включва вторични антитела, конюгирани с ензим.

Има няколко най-често използвани опции за настройка на метода IGCC:

  • директна имунофлуоресценция (IF),
  • индиректна пероксидаза.

Първоначално визуализирането на тъканни антигени чрез методи на ензимно имунооцветяване се извършва чрез директен метод, като се използват ензими, директно конюгирани с антитела с известна антигенна специфичност. Този метод позволява използването на светлинен микроскоп, но е с ниска чувствителност. Чувствителността на имунохистохимичното оцветяване е значително подобрена с разработването на индиректен метод, при който маркирани с ензим вторични антитела се свързват с първични антитела.антитела, свързани с антиген. Впоследствие се появяват триетапни методи, като пероксидазно-антипероксидазния метод, авидин-биотин комплексът и др.

Съвременните системи за изобразяване на комплекса антиген-антитяло принадлежат към ново поколение ензимно-медиирани методи за оцветяване и позволяват имунологични изследвания с висока специфичност и чувствителност, като се използва само светлинен микроскоп. Това прави съвременните методи за изследване достъпни дори за лаборатории, които не разполагат със специално оборудване.

Системите за изображения имат редица предимства пред традиционните ензимно-медиирани методи:

  • осигуряват възможност за оценка на имунологичния профил и морфологичните характеристики на клетката върху един препарат (в този случай материалът за изследване може да бъде фиксиран по различни методи и позволява дългосрочно съхранение);
  • осигуряват висока чувствителност и специфичност на имунохистохимичните изследвания (например, чувствителността на метода стрептавидин-биотин на образната система LSAB (произведена от DAKO) е 8 пъти по-висока от чувствителността на комплекса авидин-биотин, а чувствителността на системата CSA (произведена от DAKO) е сравнима с методите на молекулярната биология и е подходяща за използване в in situ hy метод на бридизация);
  • значително намаляване на времето за анализ и опростяване на процедурата, като по този начин позволява едновременна обработка на голям брой проби;
  • позволяват да се открият антигени със слаба експресия;
  • системата за двойно оцветяване позволява едновременно откриване на два различни антигена върху един препарат.

Появата на системата за изображения EnVision (произведена от DAKO) беше революционен момент в историята на имунохистохимията и беше началото наза разработването на цяла серия от системи, базирани на технологията на декстран. Всички видове системи за изобразяване на светлинен микроскоп са приложими за използване на широка гама първични специфични антитела, предлагани от различни производители.

Такава многофункционалност на системите прави възможно използването им при: • имунофенотипизиране на кръвни клетки и тъкани; • оценка на функционалното им състояние; • Диагностика на патологични промени, включително рак и откриване на инфекциозни клетъчни увреждания.

Системите за изображения могат да се използват за изследвания на парафинови срезове, петна, криосрезове, отпечатъци и препарати, получени чрез центрофугиране на клетъчни суспензии. Възможността за избор на субстрат ви позволява да получите различни цветове на препаратите.

Хардуерни изисквания.

За получаване на хистологични препарати за провеждане на IHC изследвания е необходимо традиционно хистологично оборудване за получаване на висококачествени микропрепарати: апарат за хистологично окабеляване на материала, апарат за изливане на парафинови блокове, микротом, микроскоп.

Допълнително оборудване за IHC метода. Методите на IHC се отнасят до ръчни полуколичествени микро методи, които определят подходящия набор от допълнително оборудване, необходимо за метода.

А именно: 1. Батерия от контейнери за депарафинизация и рехидратация (резервоари за оцветяване) около 12 бр. 2. Стъклария (колби за буфери, чаши, цилиндри, контейнери, бутилки) 3. Термо и химически устойчив контейнер с държач за термична обработка на материал за демаскиране на антиген. 4. Оборудване за топлинна обработка:

  • вана за IHC (до 100 градуса C, прецизна)
  • микровълнова фурна (домакински, мощност не по-малка от 800 W)
  • електрическа печка (битова)
  • тенджера под налягане (битова)

5. пипети с комплект накрайници

  • малък обем 0,5 - 10 µl
  • среден 1-50, 20-200
  • големи до 1000 µl, до 5000 µl

6. Хидрофобен молив за IHC 7. Везни (за самостоятелно приготвяне на соли за буфери) 8. pH метър (за контрол на pH на приготвените буфери) 9.Хладилник за съхранение на специфични реактиви и буфери (битови) 10. Термостат

Отчитане на резултатите от изследванията.

За да се вземат предвид резултатите от IHC изследването, е необходимсветлинен микроскоп от съответния клас. Системите за архивиране и анализ на изображения, състоящи се от светлинен микроскоп, цифрова камера и компютър, позволяват да се съхраняват изображения на получените микропрепарати в дигитализиран вид и да се подлагат на различни методи за морфоанализ с помощта на специализирани програми.

Тестови реагенти за IHC метода. Свободни и конюгирани антитела, системи за изобразяване (вторични антитела) засветлинен микроскоп, допълнителни реактиви, контролни материали, производство:

  • DAKO (Дания)
  • ЛАБОРАТОРИИ NOVOCASTRA (Великобритания)
  • ABCAM (Великобритания)
  • CHEMICON (САЩ)
  • ФАРМИНГЕН (САЩ)
  • СИГМА