Сравнение на методите за PCR и пиросеквинация в реално време за откриване на соматична мутация

СРАВНЕНИЕ НА PCR МЕТОДИ В РЕАЛНО ВРЕМЕ

И ПИРОСЕКВИНАЦИЯ ЗА ОТКРИВАНЕ НА СОМАТИЧНА МУТАЦИЯV617F В ГЕНА НА JANUS KINASE - 2

Научен ръководител д.ф.н. биол. науки, д.ф.н. пчелен мед. Науки

Сибирски федерален университет

Клон на Центъра за хематологични изследвания в Красноярск

Хроничните миелопролиферативни заболявания (ХМП) са група хематологични заболявания, придружени от туморна трансформация, последвана от пролиферация на миелоидни клетки, които запазват способността си да се диференцират дълго време. През 2005 г. е открита точкова соматична мутация (Jak2V617F) в гена Janus kinase-2 (Jak2), която води до заместване на валин с фенилаланин в позиция 617 и причинява нарушение на структурата на тирозин киназата, конвергенция на киназните домени, тяхното самоактивиране и поява на висока активност на тирозин киназа, което води до повишена клетъчна проли ферация и блокиране на процесите на апоптоза. Постоянното активиране на Jak2, независимо от свързването на цитокиновия рецептор с неговия лиганд, причинява увеличаване на броя на зрелите клетки от всички миелоидни хематопоетични линии. Идентифицирането на тази мутация е критично за диагностиката и мониторинга на терапията за полицитемия вера, есенциална тромбоцитемия и първична миелофиброза. Мутационният статус на Jak2 V617F и неговият алелен товар корелират с клиничната и хематологичната картина на пациенти с есенциална тромбоцитемия, докато има увеличение на броя на неутрофилите, висока скорост на образуване на тромби и интензивно развитие на миелофиброза. В тази връзка е важно да се определи не само тази мутациякачествени методи, позволяващи да се интерпретира резултатът като наличие или отсъствие на мутация, но също така и количествени методи, позволяващи да се определи алелното натоварване.

Целта на работата е да се идентифицира качествено наличието на мутация V617F в гена Janus kinase-2 при пациенти със съмнение за хронично миелопролиферативно заболяване и да се сравнят получените резултати с данни за относителното количество на мутантния алел.

Геномна ДНК се изолира от левкоцити от цяла кръв с помощта на реагентите DNA-express-blood (NPF Litekh) иDNA-sorb-B (Amplisens). Качественият анализ на наличието или отсъствието на мутация в Jak2 гена се извършва с помощта на комплекта за амплификация SNP-express-RV (NPF Litekh). В този случайпродуктите на полимеразна верижна реакция (PCR) бяха открити в реално време на iCycler iQ5 cycler (BioRad). Разработчиците предлагат схема за интерпретиране на анализ на соматични мутации, подобна на наследствените мутации, присъстващи във всички клетки. Резултатите от анализа ни позволяват да направим три вида заключения: хомозиготни за нормалния алел; хетерозиготни и хомозиготни за патологичния алел. Анализът се извършва според кривите на натрупване на фоновия сигнал от всяка проба. За хетерозиготна проба с наследствена мутация, разликата в циклите на изходните криви на натрупване на флуоресцентен продукт с нормален и мутантен вариант трябва да бъде по-малка или равна на 1,5. Количественият анализ беше извършен чрез пиросеквениране с помощта на системата за генетичен анализ PyroMark AmpliSense Piroscreen върху пиросеквенсор PyroMark ТМ Q24 (Qiagen).

В хода на извършената работа са изследвани 129 пациенти със съмнение за CMPD, от които при 39 е открита мутация. Числото беше сравненотромбоцити, еритроцити и левкоцити при изследваните пациенти и наличие на мутация V617F в гена Jak2. Според литературата мутацията се определя в 90-95% от случаите на полицитемия вера, 50-70% от случаите на есенциална тромбоцитемия и 40-50% от случаите на миелофиброза. В нашето проучване честотата на мутацията сред пациенти с повишен брой кръвни клетки и на трите клетъчни линии, което е типично за диагнозата полицитемия вера, е 93%. Изследването на здрави доброволци (25 души) и пациенти с клетъчен брой под нормата (21 души) не разкрива мутация, което съответства на очаквания резултат, тъй като мутацията води до увеличаване на броя на клетките и на трите клетъчни линии.

Когато анализирахме тази соматична мутация по метода PR-RW, срещнахме примери, когато разликата в цикъла беше 1,68; 1,88; 2.2, тоест повече от 1.5, но все още беше доста малък, което показва наличието на клетки, носещи мутацията. Във всички описани случаи беше невъзможно да се интерпретират еднозначно получените резултати. В тази връзка, ние допълнително избрахме 39 проби, идентифицирани от горния тест като съмнителни хетерозиготи, хетерозиготи и хомозиготи за мутантния алел (разликата в циклите беше от 1,68 до 4) и извършихме техния количествен анализ, за да идентифицираме относителното съдържание (в%) на мутантния алел чрез пиросеквениране. След това оценихме зависимостта на разликата между изходните цикли на кривите на натрупване на флуоресценция по време на PCR метода в реално време и алелното натоварване, определено с помощта на технологията за пиросеквениране. От стойността на изходния цикъл на мутантния алел се изважда стойността на нормалния изходен цикъл (фиг. 1).

Фиг.1 Зависимост на разликата в циклите на изхода на флуоресцентните криви от процента на алелнитетовари.

Коефициентът на рангова корелация на Spearman беше -0,88, P