ВИРУСЕН ХЕПАТИТ С НОВИ ПОДХОДИ КЪМ ИЗУЧВАНЕТО НА ПАТОГЕНЕЗАТА И РАЗРАБОТВАНЕ НА ДИАГНОСТИКА И

Като ръкопис

МАСАЛОВА ОЛГА ВЛАДИМИРОВНА

ВИРУСЕН ХЕПАТИТ С: НОВИ ПОДХОДИ КЪМ ИЗУЧВАНЕТО НА ПАТОГЕНЕЗАТА И РАЗРАБОТВАНЕТО НА ИНСТРУМЕНТИ ЗА ДИАГНОСТИКА И ПРЕВЕНЦИЯ

за степен

Доктор на биологичните науки

Работата е извършена във Федерална държавна институция „Изследователски институт по вирусология. DI. Ивановски” Министерство на здравеопазването и социалното развитие на България

Научен съветник:

Доктор на биологичните науки, професорКущ Алла Александровна

Официални опоненти:

b. д-р, професор, академик на Руската академия на медицинските наукиЗверев Виталий Василиевич;

Доктор на медицинските науки, професорМихаил Иванович;

b. н., професорНаровлянски Александър Наумович

Водеща организация: Изследователски институт по кръвопреливане на името на А.А. Богданова ФГБИ "Център за хематологични изследвания" на Министерството на здравеопазването и социалното развитие на България

Дисертацията може да бъде намерена в библиотеката на Федералната държавна институция „Изследователски институт по вирусология на името на N.N. DI. Ивановски” Министерство на здравеопазването и социалното развитие на България

Резюмето е изпратено на ……. 2011 г

Научен секретар на Дисертационния съвет

Доктор на медицинските наукиБурцева Елена Ивановна

Уместност на проблема

Въпреки напредъка в изследването на молекулярно-биологичните свойства на вируса, все още няма единна концепция за патогенезата на HCV инфекцията и ясно разбиране на механизма на увреждащия ефект на HCV върху чернодробните клетки. Все още не е напълно ясно кои вирусни фактори и фактори на гостоприемника определят резултатите от острия хепатит С (AHC) – реконвалесценция илиобразуването на хронична инфекция, а също така причиняват хода на CHC, прогресиращ до цироза [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Възможностите за изследване на структурата на HCV и патогенезата на заболяването са ограничени от трудностите при култивирането на вируса in vitro и експерименталната инфекция на животни. Повечето изследователи смятат, че HCV няма директен цитопатогенен ефект и основният фактор за хронифицирането и прогресията на заболяването е нарушение на Т-клетъчния отговор, а именно дисбаланс в съотношението на Th1 и Th2 лимфоцити и техните секретирани цитокини [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

Протеините на вируса не са достатъчно проучени поради ниската им достъпност, тъй като HCV циркулира и се натрупва в тялото на пациентите в ниски концентрации. Информацията за ефекта на HCV протеините върху клетките и тялото е противоречива: вирусните протеини могат да потиснат или засилят имунния отговор, да инхибират или индуцират апоптоза [Irshad, Dhar, 2006, Pindel, Sadler, 2010, Siavoshian et al., 2005, Tang, Gris, 2009]. Досега функционалната роля на HCV протеините при образуването на хроничен хепатит не е изяснена и не са идентифицирани инфекциозни маркери, свързани с активността и стадия на CHC. Изясняването на структурата и свойствата на вирусните протеини е необходимо както за решаване на теоретични проблеми (локализация на антигенни и имуногенни детерминанти, определяне на защитни епитопи), така и за решаване на проблемите на практическата медицина - създаването на профилактични средства, терапевтични лекарства и диагностични тестови системи.

Подобряването на диагностиката на хепатит С е спешен проблем за общественото здраве.За да се ограничи разпространението на HCV инфекцията, надеждното откриване на HCV в кръвта и кръвните продукти е от особено значение. Индикацията за анти-HCV антитела основно решава проблемаетиологична диагноза, но не характеризира хода на инфекцията и не решава проблема с прогнозирането на изхода от заболяването. Поради тези причини е важно да се разработят методи за директно определяне на виброспецифични маркери - РНК и протеини, както в кръвния серум, така и директно в телесните клетки. Откриването на тези HCV маркери може да реши проблема със серонегативния прозорец, както и да отговори на въпроса за репликацията на HCV и вирусния товар.

Горното показва уместността на работата, насочена към цялостен анализ на ролята на вирусните фактори (HCV РНК и протеини) и имунния отговор на гостоприемника (спектър от антитела срещу HCV, имунокомпетентни клетки, цитокини и други имунорегулаторни молекули) в патогенезата на хепатит С. Тези знания са необходими за разработването на ефективни инструменти за диагностициране, превенция и създаване на специфични лекарства за лечение на хепатит С, което ще направи възможно контролирането на това широко разпространено заболяване.

Изброените нерешени проблеми в изследването на хепатит С определят актуалността на тази работа, целта и задачите, които са поставени в нея.

Цел и задачи на изследването

Целта на работата е да се разработят критерии за оценка на активността на хепатита чрез цялостно определяне на HCV РНК и протеини в черния дроб и периферната кръв, маркери за функционалната активност на имунната система при пациенти с остър и хроничен хепатит С за прогнозиране на резултатите от заболяването и, въз основа на получените данни, разработване на състав на ваксина, който осигурява ефективен имунен отговор срещу HCV.

За постигане на целта бяха поставени редица фундаментални и приложни задачи:

Научна новост

Използвайки получените моноклонални антитела (MCA) към HCV протеини, структурната организация на 10 антигеннидетерминанти, които не са описани по-рано. За първи път е установено, че антигенни детерминанти на HCV протеини се откриват в инфектирани чернодробни клетки и периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCs) на пациенти с хепатит С с различна честота. Пет епитопа най-често се идентифицират в протеините NS4A, NS4B и NS5A, което може да е свързано с пространствената наличност на тези детерминанти.

С помощта на имунохимични методи, разработени на базата на MCA, са получени нови данни за патогенетичната роля на HCV протеините. За първи път е установено, че при пациенти с CHC, натрупването на core протеин в черния дроб и в PBMC директно корелира с откриването на репликативната форма на HCV РНК. По този начин основният протеин може да служи като маркер за активна вирусна репликация. Честотата на откриване на репликативната форма на HCV РНК, както и експресията на протеина NS4A в черния дроб и в PBMC на пациенти с CHC, е намалена при тежки некро-възпалителни процеси в черния дроб, което може да показва намаляване на репликативната активност на HCV с прогресирането на заболяването. За първи път е показано, че хистологичната активност на CHC и повишаването на нивото на чернодробните ензими е пряко свързано с наличието както на HCV геномна РНК, така и на HCV протеини в чернодробната тъкан, HCV РНК и core протеин в кръвните серуми и HCV протеини в PBMC. При хроничен хепатит С за първи път е установена пряка връзка между експресията на протеина NS5A в черния дроб, производството на антитела към този протеин, повишаването на хистологичната активност и развитието на фиброза, което ни позволява да разглеждаме NS5A като един от маркерите за степента на увреждане на чернодробната тъкан.

Анализът на HCV протеини в черния дроб на пациенти с хепатит С за първи път предостави пряко доказателство за по-висока транскрипционна активност на HCV при OHC в сравнение с CHC. Пряка връзка между натрупването на ядро, NS3 и NS5A протеини в хепатоцитите и некро-възпалителнипромени в чернодробната тъкан. Интензивната експресия на NS4A и NS3 протеини в черния дроб в периода от около 1 месец след изявата на OHC е предиктор за спонтанна реконвалесценция.

За първи път е установено, че натрупването на HCV протеини в PBMCs е свързано с имунни нарушения - намаляване на дела на мононуклеарните клетки и лимфоцитите в левкоцитната популация. При OHC намаляването на броя на CD16+-лимфоцитите е свързано с по-активна експресия на HCV NS3 и NS5A протеини в черния дроб (r = -0,7, p

Съдържанието на миши лимфоцити, експресиращи маркери на Т-клетки (CD4+ и CD8+) и В-клетки (CD19+), по отношение на всички CD45+-позитивни клетки (левкоцити), се оценява с помощта на FITC- и белязани с фикоеритрин антитела чрез трицветна поточна цитометрия (BD Biosciences, САЩ). Анализът беше извършен на поточен цитометър FACS CALIBUR (Becton Dickinson, САЩ) с помощта на софтуера Cell Quest заедно с Ph.D. Пичугин А.В. и дмн, проф. Атаулаханов Р.И. (FGBU "SSC България" Институт по имунология "FMBA България).

ELISpot. Определянето на броя на клетките, секретиращи IFN-, се извършва с помощта на ELISpot мишка IFN-тест система (R&D системи, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя.

Определяне на съдържанието на цитокини IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-, TNF- в серумите на пациентите и в супернатантите на културата се извършва чрез ELISA с помощта на тестови системи от Vector-Best (Новосибирск) и Protein Contour (Санкт Петербург). Концентрацията на цитокини в супернатантите, получени по време на култивирането на стимулирани миши спленоцити, се измерва чрез ELISA, като се използват тестови системи за определяне на IFN-, IL-2 - Mabtech (Швеция) и TNF- - BioLegend (САЩ).

Ниво на разтворими форми на диференциационни антигени (sFas, sCD38, sHLA-DR и sHLA-I) се определят чрез сандвич ELISA, като се използват MCAs от серията ICO и поликлонални антитела срещу човешки мембранни антигени. Тези тестови системи са разработени и любезно предоставени от проф. В.В. Новиков (Нижегородски държавен университет на името на Н. И. Лобачевски).

Статистическата обработка на резултатите е извършена с помощта на програмите "Biostatistics" (версия 4.03) и "Statistica 6". Използвани са следните параметрични и непараметрични тестове: t-тест на Student, U-тест на Mann-Whitney, линейна регресия на Pearson и коефициенти на рангова корелация на Spearman, тест на Pearson (-квадрат) и точен тест на Fisher. Две зависими (свързани) проби бяха сравнени с помощта на теста на Wilcoxon или метода на знаците. Сравнението на няколко независими проби беше извършено с помощта на двупосочен рангов анализ на Friedman (Friedman ANOVA). Нивото на статистическа значимост се определя при p = 0.05