Възможност за определяне на пирогенни примеси във вода за инжектиране чрез луминисцентен метод
Н. В. Глазова, В. Л. Багирова, А. А. Крашенинников, А. В. Караваева, Санкт Петербургска академия по фармацевтична химия, Научно-производствена компания "Лумекс", Институт за стандартизация на лекарствата
Основният източник на пирогенни примеси във водата за инжектиране е комплекс от ендотоксин с протеин от грам-отрицателни бактерии, който е част от външната клетъчна мембрана [1]. Отделянето на свързания протеин е възможно само в присъствието на основи или фенол, което е малко вероятно във вода за инжектиране. Следователно, по-нататък терминът "бактериални ендотоксини във вода за инжекции" се отнася до комплекса липополизахарид-протеин.
Доскоро фармакопеите на много страни използваха зайци за тестване за пирогенност. Въпреки това, фармакологичният тест за определяне на пирогенността при зайци е качествен, т.е. забранителен или разрешителен. В допълнение, резултатите от теста зависят от индивидуалните характеристики на животните, тяхното състояние. Не всички лекарства могат да бъдат тествани с този метод [2].
Един от активно развиващите се в момента начини за контрол на пирогенността на лекарствата, който е включен във фармакопеите на много страни, включително и в България, е LAL тестът. Методът се основава на способността на лизата от амебоцити (кръвни клетки) на подковоноса Limulus polyphemus да реагира специфично с ендотоксини на грам-отрицателни бактерии - липополизахариди. При взаимодействие на ендотоксин и лизат прозрачната реакционна смес става мътна или се образува твърд гел (тромбоза), който служи като индикатор за наличието на ендотоксин в реакционната смес.
Тестът е силно специфичен за ендотоксини от Грам-отрицателни бактерии. Неговата чувствителност е многократно по-висока от тази на фармакопейния тест зазайци (Таблица 1).
LAL-тестът има широк спектър от приложения: контрол на качеството на вода, парентерални лекарства, инжекционни и инфузионни разтвори и медицински изделия, при които определянето на нивото на бактериалните ендотоксини е предписано от действащите разпоредби, за оценка на качеството на валидиране във фармацевтичната индустрия. Този тест може да се използва и за оценка на санитарното състояние на питейната вода и индиректно определяне на съдържанието на бактерии в нея. Към днешна дата LAL тестът е твърдо въведен в практиката на производство и контрол на лекарства във водещите фармацевтични компании в света. Въпреки високата чувствителност на LAL теста, той все пак не е експресен метод. Освен това тестът има и някои ограничения. За разлика от пирогенния тест върху зайци, който открива широкоспектърни пирогени, LAL тестът може да открива само бактериални ендотоксини, високомолекулни комплекси, които са структурни компоненти на външната клетъчна стена на грам-отрицателните бактерии.
Във връзка с развитието на луминесцентните методи за анализ и появата на българския пазар на апарати за измерване на луминесценцията (например Fluorate02 AVFF-DC) е перспективно разработването на луминесцентен експресен метод за определяне на пирогенността, който е удобен за използване в аптека и на различни етапи от мониторинга на водата за инжектиране. Методът за определяне на пирогенността на вода за инжекции се основава на измерване на интензитета на луминесценция в присъствието на липополизахарид-протеинов комплекс (примеси). Интензитетът на луминесценцията се записва с помощта на биофлуиден анализатор от типа Fluorat-02. Комплектът за анализ включва контролен луминесцентен стандарт (CLS), който трябва да бъде предварително калибриран споредреферентен луминесцентен стандарт (ELS), съхраняван от производителя.
За да се установи праговата стойност на интензитета на луминесценция, която определя положителен или отрицателен резултат за наличието на пирогенни примеси в анализираната вода за инжектиране, проведохме паралелно определяне на пирогенността при зайци, определихме концентрацията на бактериални ендотоксини според LAL теста и едновременно с това измерихме индекса на луминесценция на устройството Fluorat-02.
Тестовете за пирогенност върху зайци бяха проведени в съответствие с Глобалния фонд XI, p. 186. Концентрацията на бактериални ендотоксини се извършва съгласно LAL теста по два начина: качествен гел тромб тест съгласно OFS 42-002-00 [3] и количествен колориметричен метод [1, 4].
За LAL теста са използвани реагенти, произведени от Charles River Endosafe Inc (САЩ) (удостоверение за регистрация на МЗ № 99/113 от 18.08.99 г.), доставени в България от фирма Tandra.
Използвахме LAL реагент с чувствителност от 0,125 UDe/ml (партида # L2061L) и 0,003 UDe/ml (партида # L3111L), контролен стандарт за ендотоксин (0,5 μg на флакон), титруван от RSE (FDA) (партида # ES-6), вода за анализ чрез LAL тест (партида # P01411).
Качественият анализ на съдържанието на бактериални ендотоксини се извършва в съответствие с OFS 42-0002-00 [3]. Количественият анализ е извършен по колориметричен метод [1, 4].
Изчисляване на средната геометрична стойност на интензитета на луминесценция в тестовата проба