1985 - клониране на костна риба 13 1996 - Овцата Доли
1998 г. - първата крава[15].
1999 г. - първата коза[16].
2001 г. - първата котка[17].
2002 г. - първият заек[18].
2003 г. - първият бик[19], муле[20], елен[21].
2004 г. - първият опит на клониране за търговски цели (котки).[22]
2005 г. - първото куче (афганистанска хрътка на име Снупи).[23]
2006 г. - първи пор
2007 - второ куче [24]
2008 г. - третото куче (лабрадор на име Чейс). Клониран по правителствена поръчка[25]. Начало на комерсиалното клониране на кучета[26]
3. Методи за клониране на животни
Последните десетилетия на 20 век бяха белязани от бурното развитие на един от основните клонове на биологичната наука - молекулярната генетика. Още в началото на 70-те години учените в лабораторията започват да получават и клонират рекомбинантни ДНК молекули, да култивират клетки и тъкани на растения и животни в епруветки. Появи се нов клон на генетиката, генното инженерство. На базата на неговата методология започват да се развиват различни биотехнологии и да се създават генетично модифицирани организми (ГМО). Появи се възможността за генна терапия за някои човешки заболявания, а последното десетилетие на 20-ти век бе белязано от друго важно събитие - беше постигнат огромен напредък в клонирането на животни от соматични клетки.
Особено голям отзвук сред световната общественост получи изследването на шотландски учени от университета Рослин, които успяха да получат генетично точно копие на клетки от млечната жлеза на бременна овца. Клонираната овца на име Доли се развива нормално и дава първо едно, а след това още три нормални агнета. След това се появиха редица нови съобщения за възпроизвеждането на генетични близнаци на крави, мишки, кози, прасета от соматичните клетки на тезиживотни. При примати, по-специално при маймуни, все още не е възможно да се получат клонинги, като се използват клетки от възрастен организъм, фетус или дори ембрионални стволови клетки.
Въпреки това, работата в тази посока се извършва активно. Миналата година се появи доклад за клоново възпроизвеждане на потомство на примати чрез ембрионално делене. Американски изследователи успяха да получат генетично идентични ембриони на маймуна резус чрез разделяне на бластомерите на ембриона на етапа на делене. От ембриона се роди напълно нормална тетра маймуна.
Този тип клониране осигурява генетично идентично потомство, което води до близнаци, тризнаци и повече генетични близнаци. Това дава възможност да се провеждат теоретични изследвания за ефективността на нови методи за лечение на определени заболявания, става възможно да се повторят научните експерименти върху абсолютно генетично идентичен материал. Чрез имплантиране на ембриони последователно в една и съща сурогатна жена е възможно да се изследва влиянието на нейното тяло върху развитието на плода [31].
Разработените методи за клониране на животни все още са далеч от съвършенство. По време на експериментите се наблюдава висока смъртност на фетуси и новородени. Много теоретични въпроси за клонирането на животни от една соматична клетка все още не са ясни.
Въпреки това успехът, постигнат в клонирането на овце и маймуни, показа теоретичната възможност за създаване на генетични копия и на човек от една клетка, взета от някой от неговите органи. Много учени с ентусиазъм прегърнаха идеята за клониране на хора.
3.1 Методи за ядрена трансплантация
У нас Б.В. Конюхов и Е.С. Платонов през 1985 г. разработва метод за по-малко травматичен ядрен трансфер чрез микроманипулация. Протича на два етапа: първиЗоните на пелуцида и плазмената мембрана се пробиват с тънка микропипета и се отстраняват пронуклеусите, след което диплоидното ядро на донора се въвежда в същия отвор с друга пипета с по-голям диаметър (12 μm). В този случай цитоплазмата на зиготата и транспортираното донорно ядро са по-малко увредени.
Ядрената трансплантация може да се извърши и по друг начин, като се използват цитохалазини (вещества, синтезирани от гъбички).
Цитохалазин В разгражда микрофиламентната структура и спомага за уникалното подреждане на ядрото. Ядрото остава свързано с клетката чрез тънко стъбло цитоплазма. По време на центрофугирането този мост се прекъсва и се образуват безядрени клетки (цитопласти) и кариопласти, които представляват ядра, заобиколени от тънък слой цитоплазма и цитоплазмена мембрана. Цитопластите се отделят от непокътнати клетки в градиент на плътност. Те запазват способността си да се прикрепят към повърхността на съда за култура и могат да се използват за сливане с кариопластите на други клетки, за да се получи жизнеспособна клетка [14][12].
Методите за изолиране на кариопластите са малко по-сложни и включват серия от центрофугиране, разделяне с градиент на плътност и т.н. В някои случаи танталови частици с диаметър 1–3 µm се добавят към сместа от клетки и кариопласти. Те проникват в клетките и никога в кариопластите, така че по-тежките клетки се установяват по-бързо от кариопластите.
Цитопластите съдържат всички видове органели, присъщи на нормалната клетка, запазват способността си да се прикрепят към субстрата, да образуват сгъната мембрана, да се движат и да извършват пиноцитоза.
Кариопластите са заобиколени от тънък слой цитоплазма (около 10% от общата клетъчна цитоплазма), съдържат компактен ендоплазмен ретикулум, няколко митохондрии и рибозоми. В някои клетъчнилинии от 1/10 кариопластите е в състояние да възстанови целия загубен обем на цитоплазмата и да се възстанови в жизнеспособни клетки.
За клетъчна реконструкция, суспензия от кариопласти във физиологичен буфер се добавя към монослоя на цитопластна култура в съотношение 100 кариопласта на 1 цитопласт. Цитопластите вече трябва да са покрити с инактивирани вирусни частици. Инкубирайте при 4°C за 45 минути и след това за още 45 минути при 37°C. Промива се с разтвор на Earl за отстраняване на неслети кариопласти [8].
3.2 Метод на клониране SLIC (независимо от последователност и лигиране клониране).
Стив Елидж и неуморната Мами Лий отново зарадваха научната общност с оригиналния си метод за клониране. Новият метод се нарича SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новостта е модификация на добре познатия метод LIC (ligation-independent cloning) - клониране без използването на лигаза. За да се вмъкне ДНК фрагмент във вектор, използвайки класическия LIC метод, е достатъчно да се смесят векторът и вложката, в чиито краища има разширени едноверижни региони, които са комплементарни един на друг. Когато тази вложка се "залепва" към вектора, образувайки рекомбинантен плазмид с прякори в двете вериги. Полученият плазмид се трансформира в Е. coli, чиято възстановителна система възстановява нормалната структура на плазмида.
Методът SLIC е същият като LIC с единствената разлика, че векторът и инсертът са "коалесирани" в присъствието на RecA протеина. Тази лека модификация на метода позволява да се постигне достатъчно висок добив (1 ng от вектора е способен да произведе 3900 трансформанти), а също и да се опрости самата процедура на клониране. Така че, ако за класическия LIC метод е необходимо точно да се регулира размерът на едноверижните секции на вектора и вложката (така че в резултат на кръстовищетовектори и вложки се оказаха прякори), тогава методът SLIC допуска наличието на разширени пропуски [19].