7 Комплекс от молекулярно-генетични методи за мониторинг на HIV инфекция

* хроматограмата показва два пика, съответстващи на различни нуклеотиди;

pro, протеазен ген; rt, ген за обратна транскриптаза.

Беше показано, че първата група несъгласувани (точки 1-5 от Таблица 10) се появява поради възможното присъствие на няколко квази-вида в популацията на вируса, които в някои случаи се разпознават на хроматограмата като няколко пика.

Във втората група проби (№ 123 и 155) несъответствието на мутациите се свързва с разликата в дължините на анализираните генни фрагменти на обратната транскриптаза, в резултат на което мутацията на полиморфизма G333D/E не може да бъде открита с помощта на тестовата система AmpliSense. Тъй като мутациите в полиморфизма не причиняват развитие на резистентност на ХИВ към АРВ, липсата на данни за мутацията G333D/E не влияе върху резултатите за наличието или отсъствието на резистентност към лекарства.

Най-голям интерес представлява мутацията T74S в протеазния ген (проба #1): програмата ViroSeq разглежда тази мутация като неизвестна или нова. Според програмата Stanford HIVDB мутацията T74S в присъствието на други мутации причинява намаляване на чувствителността към нелфинавир, което програмата интерпретира като потенциално ниски нива на резистентност към това лекарство. Този факт показва, че в момента информацията, съдържаща се в програмата ViroSeq, започва да остарява.

Тестовете за лекарствена резистентност на ХИВ бяха използвани за оценка на разпространението на първична резистентност към ХИВ през 2005 г. и 2007 г. В резултат на изследването, от 76 анализирани кръвни проби, събрани през 2005 г. в района на Москва, специфичен сигнал за усилване е получен в 57 проби, в 19 проби катосигналът не е получен. В резултат на секвениране на HIV фрагменти в 57 проби не е открита нито една първична мутация на HIV резистентност. Тъй като АРВ терапията се използва в района на Москва от 1997 г., това позволява да се правят оптимистични прогнози относно ефективността на масовото използване на терапията в изследваната област без предварително тестване на резистентност при всеки пациент.

По време на второто изследване през 2007 г., от 297 проби, нуклеотидната последователност на HIV-1 pol гена е определена в 257 (86,5%) проби, 40 проби дават отрицателен резултат от PCR. В резултат на секвениране на 257 проби, високо ниво на лекарствена резистентност на HIV-1 се наблюдава с ниска честота от 0,8% (DR към ненуклеозидни инхибитори на обратната транскриптаза) и се изразява чрез наличието на мутация K103N в гена за обратна транскриптаза. Ниска лекарствена резистентност, насочена към лекарства от класа на протеазните инхибитори (нелфинавир и атазанавир), е открита при 3 пациенти (1,2%) и е причинена от заместванията M46I и M46L в протеазния ген.

Наблюдение на разпространението на ХИВ с помощта на молекулярно-генетични методи

Разработена е техника за типизиране, базирана на ДНК секвениране, за проследяване на разпространението на различни подтипове ХИВ в България.

Разработената техника за генотипиране на HIV, базирана на секвенирането на четири геномни фрагмента (gag, pro, rev и env), позволява да се идентифицират с висока точност повечето от известните подтипове на HIV, включително рекомбинантни форми. За амплифициране на gag фрагмента бяха избрани праймери, фланкиращи региона на р24 гена, с дължина 530 bp. За амплифициране на env фрагмента, праймери, фланкиращи областта на gp120 гена с дължина или 1100b.p., или 410 b.p. (когато е невъзможно да се получи по-голям фрагмент). Амплификацията на геномните фрагменти на HIV протеазата и обратната транскриптаза е описана в глава 5 на дисертацията. Получените продукти могат да се използват както за генотипиране, така и за определяне на резистентност към ХИВ лекарства. За генотипиране полимеразните фрагменти играят спомагателна роля, но за по-точна идентификация на някои рекомбинати, например AG, BC, BF и много мозаечни форми, тяхното използване е препоръчително.

Амплификацията на всички фрагменти беше извършена в два кръга (Nested - PCR), което направи възможно решаването на проблема с чувствителността на теста, свързан с променливостта на вируса. Нуклеотидната последователност беше дешифрирана чрез секвениране на ДНК. Анализът на HIV нуклеотидните последователности, получени в резултат на секвениране на ДНК, беше извършен с помощта на програми, които са свободно достъпни в Интернет: RIP 3.0 (http://www.hiv.lanl.gov) и NCBI Genotyping (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Тези програми позволяват да се определят не само всички известни подтипове на ХИВ, но и техните рекомбинантни форми. Идентифицирането на рекомбинантни форми също се улеснява от едновременния анализ на четири фрагмента от генома на HIV.

Тази методология е използвана за изследване на разпространението на различни варианти на ХИВ в България през 2003 и 2007 г. В резултат на това беше показано, че ХИВ подтип А запазва доминиращата си позиция: 92,3% през 2003 г. и 90,3% през 2007 г. Резултатите от типизирането на HIV в проби, получени от пациенти през различни години, остават практически непроменени от 1997 г., когато субтип А започва да доминира в популацията на наркозависимите (Бобков, 1997; Лукашов, 1998). През 2003 г. разпространението на подтип А сред пациенти с различни начини на предаване на ХИВ е подобно на данните, получени през 1997-2003 г.gg. при анализ на пациенти от групата на наркозависимите (Бобков, 2001, 2004). Това може косвено да показва, че този подтип също е започнал да се разпространява по полов път. Рекомбинантната форма на АБ, открита за първи път при наркомани, в общата популация от пациенти започва да представлява малък процент (не повече от 1%).

Анализът, извършен върху проби от заразени с ХИВ пациенти през 2007 г., не разкрива G подтип (типичен за Волгоградска област), а рекомбинантната форма A/B е открита само в 1 проба, което е по-малко от 1%.

През 2007 г. се наблюдава появата на нови варианти на ХИВ, което изисква по-задълбочено проучване, за да се изясни ролята им в общия епидемичен процес. Нова находка е открита в Алтайския край, където рекомбинантната форма A/G е открита с висока честота (повече от 42%). Има вероятност този вариант на ХИВ да е внесен от Казахстан, където по данни от 2001-2003 г. рекомбинантен A/G се среща с честота от 4,7% (Eyzaguirre, 2007).

ОБОБЩЕНИЕ

  1. Разработените молекулярно-генетични подходи, предназначени за откриване на HIV провирусна ДНК в кръвни левкоцити, позволяват: да се намали времето за диагностика при деца, родени от HIV-инфектирани майки, до 4-6 месеца вместо 12-18 месеца и да се потвърдят съмнителни резултати от IB, както и да се извърши ранна диагностика на HIV инфекция при контактни лица със съмнение за скорошна инфекция.
  2. Доказана е ефективността на нов интегриран подход за решаване на проблема с инфекциозната безопасност на донорската кръв, включително разработването на методология и алгоритъм за провеждане на молекулярно-генетичен скрининг на донорска кръв успоредно с вече използвания серологичен скрининг. Предложеният подход и методите за прилагането му дават възможност за увеличаванеизследователска производителност до 200-300 проби на ден, като същевременно се поддържа висока ефективност при откриване на инфекциозни агенти.
  3. Разработените тест системи за количествено определяне на ХИВ РНК имат високи аналитични и диагностични характеристики при по-ниска цена в сравнение с чуждестранните тест системи. Показана е възможността за тяхното използване за оценка на прогнозата на хода на заболяването и ефективността на АРВ терапията.
  4. Разработените алгоритми за подготовка и сертифициране на стандартни проби позволиха да се създаде панел от стандартни ХИВ проби, които могат да се използват за външен и вътрешнолабораторен контрол на качеството на изследванията, свързани с молекулярната диагностика на ХИВ инфекцията.
  5. Разработената тестова система за откриване на мутации в резистентността на HIV към АРВ лекарства има по-висока аналитична и диагностична производителност, както и по-ниска цена в сравнение с чуждестранните тестови системи. Доказано е, че може да се използва както за ранно идентифициране на причините за неефективността на АРВ терапията и по-нататъшна корекция на режима на лечение, така и за епидемиологично наблюдение на разпространението на първична резистентност към HIV.
  6. Разработеният метод за генотипиране на ХИВ позволява да се определят по-голямата част от известните подтипове на ХИВ-1, включително рекомбинантни форми, което от своя страна позволява да се подобри епидемиологичното наблюдение на разпространението на различни варианти на ХИВ в Руската федерация, процедурата за епидемиологично изследване на нови случаи на инфекция и диагностиката на ХИВ инфекция.
  7. С помощта на разработената методика за генотипиране на ХИВ е показано разпространението на различните субтипове на ХИВ в България през различните години. ХИВ подтип А запазва доминиращата си позиция, започвайки от1997 г. и представлява повече от 90% от всички ХИВ инфекции. От 2007 г. е показано разпространението на нов за България вариант на ХИВ - рекомбинантната форма A/G (7%). Други варианти на ХИВ представляват по-малко от 3% от всички ХИВ инфекции.

СПИСЪК НА ТРУДБИТЕ, ПУБЛИКУВАНИ ПО ТЕМАТА НА ДИПЛОМНАТА ТЕЗА

  1. Богословская, Е.В. Концентриране на вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) чрез ултрацентрофугиране като начин за повишаване на чувствителността на PCR тест системите за диагностика на HIV инфекция. / Е.В. Богословская [и др.] // Резюмета на доклада на петия български конгрес на лекарите по инфекциозни болести. - М., 1998. - С. 40.
  2. Кравченко, А.В. Тимазид в комбинация с chivid и invirase в комплексната терапия на пациенти с HIV инфекция. / А.В. Кравченко, Л.В. Серебровская, Е.Л. Голохвастова, Г.А. Шипулин, Е.В. Богословская и др. // Епидемиология и инфекциозни болести.–1998. - № 5. - С. 51-53.
  3. Шипулин, Г.А. Мястото на полимеразната верижна реакция в диагностиката на HIV инфекцията. / Г.А. Шипулин, К.А. Саркисян, Е.В. Богословская и др. // Епидемиология и инфекциозни болести.–1998. - № 5. - стр. 59-62.
  4. Галина, М.В. Двугодишен опит с високоефективна антиретровирусна терапия (HAART) за HIV инфекция. / М.В. Галина, Е.Л. Голохвастова, Н.М. Моргунова, А.В. Кравченко, Б.М. Груздев, Е.В. Богословски. // Българско списание ХИВ/СПИН и свързани проблеми. - 1999. - Т. 3. - № 1. - с. 126-127.
  5. Богословская, Е.В. Разработване и тестване на PCR тест система за качествено откриване на ХИВ РНК. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, О.Ю. Шипулина, В.В. Покровски. // Алергия, астма и клинична имунология. - 1999. - № 9. - стр. 142-144.
  6. Богословская, Е.В. Определяне на концентрацията на HIV РНК с помощта на PCR тест система "Amplicor HIV-1Монитор” за оценка на ефективността на комбинираната терапия за HIV инфекция. / Е.