Аналитични методи за определяне на седиментационни константи

Понастоящем съвременните компютърни програми позволяват да се определят константите на седиментация и дифузия при условия, близки до експерименталните. За тази цел са предложени два метода, всеки от които дава възможност за едновременно определяне на коефициентите на утаяване и дифузия и, като следствие, на молекулното тегло. Изборът на метод зависи от съотношението на приноса на дифузията и седиментацията към движещата се граница. В този случай моделът на утаяване изглежда по следния начин. Както се вижда от фигурата, скоростта на движение на границата се определя от константата на утаяване на веществото, а размиването на границата се определя от константата на дифузия.

Моделът на седиментация в общия случай, когато приносите на седиментацията и дифузията са сравними по величина

Метод на Ван Холд-Вайшет

В първата стъпка разстоянието между базовата линия и платото за всяко сканиране се разделя наN(обикновено няколко десетки) хоризонтални секцииNи видимите коефициенти на утаяване,s*, се изчисляват като:

къдетоr,rm са сечението и радиусите на менискуса, съответно. Във втората стъпка стойностите наs*се изобразяват като функция на корен квадратен от времето за всяко сканиране. Пресечната точка с остаy-, която съответства на безкрайно време, дава коригираната с дифузия стойностs. За хомогенни проби всички линии трябва да се събират в една точка - една стойност на седиментационната константаs. За нехомогенна проба, линиите не се събират в една точка и средната стойност при пресичането с остаyсе използва за изчисляване на среднотегловната стойност на коефициента на утаяване,sw. Тогаварезултатите са представени като графика на процента на общия седиментационен материал като функция отs.Тази графика характеризира качеството на пробата. Фигура 24.8 показва седиментационни профили (вмъквания a и d) и анализ на van Holde-Vaischet за хомогенни (вмъквания a и b) и хетерогенни (вмъквания d-f) проби от биологични макромолекули.

Ориз. 24.8. Анализ на скоростта на движение на седиментационната граница по метода van Holde-Vaischet: a-c) данни и анализ за капсиден протеин II на бактериофаг Т7 MLD; d-f) данни и анализ за същия препарат, но в който към протеина е добавено определено количество субгеномна ДНК. Скорост на въртене 10 000 об/мин -1

При практическо приложение методът изисква изразена платова област и симулация на данни, които трябва да се използват за демонстриране на валидността на получените стойности. Методът van Holde-Weischet се използва в софтуера ULTRASCAN.

Метод на Стафорд или метод на времевата производна

къдетоsе коефициентът на утаяване,ωе ъгловата скорост на ротора,C0 е началната концентрация,rиrm са текущият радиус и радиусът на менискуса, съответно. При този метод седиментационните константи се получават по следния начин от оригиналните криви (фиг. 24.9 а).

Ориз. 24.9. Илюстрация на метода на Стафорд. а) Начални криви; б) диференциални криви; в) Нормализирани криви

Две близко разположени криви на утаяване се изваждат една от друга, давайки диференцирана крива (оттук и името "метод на производните"), както е показано на Фигура 24.9 b. Всеки седиментационен профил ще има форма на Гаус, подобна на тази, получена при използване на оптика на Schlieren (dC/dr). След това кривите се нормализират за времето и се наслагват една върху друга. На последния етапте са нормализирани за концентрация. Полученият пик има форма на Гаус, чиято позиция и ширина са свързани съответно с константите на утаяване и дифузия (фиг. 24.9 c). Фигура 24.10 показва използването на метода на Stafford за анализ на моноклонални антитела (имуноглобулин). Тук са показани абсорбционни профили, записани при дължина на вълната 280 nm (фиг. 24.10 a).

Ориз. 24.10 а) Абсорбционни профили за моноклонални антитела (имуноглобулин), записани при дължина на вълната 280 nm; b) Функцияg*(s)

Първото сканиране (черно) беше записано 13 минути след началото на центрофугирането при скорост на ротора от 45 000 rpm. Всяко следващо сканиране се прави след 12 минути (различни цветове). Остър вертикален връх на 6,02 cm показва позицията на менискуса. Още първото сканиране показва отделянето на молекулите на антителата от менискуса и образуването на граница. Имайте предвид, че при последното сканиране (зелено) молекулите изминават разстояние, равно на половината от дължината на кюветата. Наклонът на кривите на профила на абсорбция на всяко сканиране е свързан с дифузията на движещи се молекули. Конструкцията на функциятаg*(s)за изследваната проба от моноклонални антитела разкрива един голям ясен пик с коефициент на утаяване от около 6,5 S, който съответства на нативен мономер (всъщност ковалентен димер, състоящ се от 2 леки и две тежки вериги). Имайте предвид, че стойността на коефициента на утаяване на 6,5 S моноклонални антитела с молекулно тегло от около 150 kDa е значително по-ниска в сравнение с глобуларните протеини с подобна маса. Така че алдолазата с молекулно тегло 156 kDa има константа на утаяване 7,4 S (Таблица 24.3). Причината за това несъответствие е проста: формата на имуноглобулиновата молекула далеч не е квазисферична. Има Y-образна форма.

Използване на числени решения за директен анализ на даннианалитичното ултрацентрофугиране е известно от около 30 години. Въпреки това, сравнително наскоро, главно поради увеличената мощност на компютрите, те се използват за анализ на данни от аналитично високоскоростно ултрацентрофугиране. Основното предимство на числените решения е, че те могат да се използват за отчитане на разнообразието от почти всички гранични условия, наложени от крайната дължина на центрофужната клетка и ефектите на дифузия.