АНАЛИЗ НА ЦИРКУЛИРАЩАТА КРЪВНА ПЛАЗМА МИКРОЧАСТИЦИ ЧРЕЗ ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЯ
Микрочастиците (микровезикулите) са сферични структури, заобиколени от липиден двоен слой, които се секретират от повърхността на различни клетки в междуклетъчното пространство и съдържат всички компоненти на клетъчната мембрана, характерни за клетката, която ги освобождава. Микрочастиците се намират във всички телесни течности, като кръв, урина, слюнка, кърма (Cocucci E., 2009, Taylor D., 2008), което ги прави потенциален източник на биомаркери за диагностициране, прогнозиране на заболявания и наблюдение на различни състояния на тялото. Увеличаването на концентрацията на микрочастици в кръвта на пациенти с различни патологични състояния потвърждава мнението, че микрочастиците играят роля в патогенезата и развитието на заболявания, включително различни видове рак, инфекциозни заболявания, автоимунни заболявания, тромбоемболични усложнения и други (Manshouri T., 2003; Ghosh A.K., 2010; Oehmcke S., 2012). Повечето от тези проучвания обаче са наблюдателни и възможната роля на микрочастиците като предсказуеми биомаркери в стратификацията на риска от заболяване едва сега започва да се разглежда. Възникналият през последните години интерес към изследването на микрочастиците, секретирани от различни видове клетки, налага формирането на нови методологични подходи. Редица методи, използвани в тази посока, включват поточна цитометрия, ELISA, както и новите технологии Fluorescent Nanoparticle Tracking Analysis (FNTA) (Dragovic R.A., 2011). Тъй като микрочастиците съдържат същите повърхностни антигени като родителските клетки, имунофенотипирането на микрочастиците чрез поточна цитометрия в момента е най-използваният метод за тяхното характеризиране (Orozco A.F., 2010). В нашата работа, използвайки поточна цитометрия, ние изследвахме микрочастици кръвна плазма на В-лимфоцитпроизход с помощта на CD20 и CD19 антигени, които са основните маркери за фенотипизиране на В-лимфоцитите.
Изолиране на микрочастици от кръвна плазма
При изследването на микрочастиците методът на тяхното изолиране е от решаващо значение (Dey-Hazra E., 2010). В момента центрофугирането е един от основните методи за изолиране на микрочастици от кръвна плазма, но към момента няма единен стандартен протокол за изолиране. Променихме съществуващите протоколи за нашите задачи. Взета е кръв от донори в количество 5 ml, центрофугирана за 20 минути при 2500g. Получената плазма се центрофугира отново при същите условия. След това 0,5 ml плазма се центрофугира при 13000g за 40 минути при 4°C за утаяване на микрочастиците. 1 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор се добавя към утайката и отново се центрофугира. Получената утайка се разрежда в 0,5 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор и се използва за анализ.
Анализ на микрочастици чрез поточна цитометрия
Понастоящем основният метод, използван за характеризиране на циркулиращи микрочастици, е поточната цитометрия. Въпреки това, няма стандартни протоколи за определянето им. Този метод позволява да се определи относителният размер (предно разсейване, FCS) и относителната грануларност (странично разсейване SSC) на частиците. Тъй като понастоящем няма консенсус относно праговата стойност (стойност, която характеризира минималния размер на микрочастиците, които могат да бъдат открити с помощта на поточен цитометър), ние определихме праговото ниво от фоновия шум. Фоновият шум се определя от броя на събитията в двойно филтриран (0,22 µm филтър) разтвор на фосфатен буфер (Фигура 1А). За определяне на относителния размер на микрочастиците, стандартзърна за калибриране 0,3 µm, 1,1 µm, 2 µm и 3 µm, с които бяха настроени вратите за определяне на обхвата на изследваните частици (Фигура 1B). Въз основа на литературни данни размерът на микрочастиците се определя в диапазона от 0,2–2 µm, освен това границата на чувствителност на поточния цитометър не позволява определяне на везикули, по-малки от 0,3 µm.
За да оценим микрочастиците от кръвна плазма с В-лимфоцитен произход, използвахме CD20 и CD19 маркери, които са основните маркери за В-лимфоцитно фенотипизиране. За оцветяване с антитяло, 30 μl микрочастици се капват в 96-ямкова плака, добавят се 3 μl CD20-PE, CD19-FITC (компания) антитела или изотипна контрола, инкубират се за 30 минути, прехвърлят се в центрофужни епруветки, след това се добавят 2 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор и се центрофугират при 13000g. Получената пелета се разрежда в 0.5 ml PBS и се анализира на FACSCanto II поточен цитометър (BD Biosciences). За имунофенотипиране на лимфоцити се използва стандартен метод за лизис на еритроцити, последван от центрофугиране. Имунофенотипирането на лимфоцитите се извършва съгласно стандартния протокол на производителя на антитялото.
В нормалната плазма повечето микрочастици (до 80%) произхождат от тромбоцити, докато останалите произхождат от ендотела и левкоцитите (Caby M.P., 2005). Таблица 1 представя резултатите от оценката на експресията на CD19 и CD20 повърхностни антигени едновременно върху лимфоцити и върху микрочастици в пет донора.
Таблица 1 Процент на CD19 и CD20-положителни микрочастици и лимфоцити в кръвната плазма на здрави донори.