АСОЦИАЦИЯ НА МУТАЦИИТЕ НА KRAS ГЕН С КЛИНИЧНИ И ПАТОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА КОЛОРЕКТАЛЕН РАК ПРИ ПАЦИЕНТИ
Колоректалният рак (КРР) заема едно от водещите места в структурата на онкологичната заболеваемост и смъртност в развитите страни по света, заемайки трето място при мъжете и второ при жените [1, 6]. Като се има предвид структурата на заболеваемостта от рак сред мъжкото население на България, трябва да се отбележи, че злокачествените тумори на дебелото и правото черво заемат пето и шесто място в общата статистика на онкологичните заболявания. Общо туморите на дебелото черво и ректума са на второ място след рака на белия дроб. Хирургията остава оптималният метод на лечение, тъй като диагностицирането на тумора главно в късните стадии на заболяването изисква бързи и радикални мерки за подпомагане на пациента за кратко време. Въпреки това съвременните химиотерапевтични методи, насочени към намаляване на размера на тумора, забавяне на туморния растеж и предотвратяване на появата на нови метастази, са не по-малко важни при лечението на CRC.
Използването на таргетни лекарства от ново поколение, като моноклонални антитела срещу EGFR (рецептор на епидермален растежен фактор) е увеличило общата преживяемост на пациенти с метастатичен CRC, ако имат див тип KRAS ген (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma virus oncogene homologue). Генът KRAS служи като една от връзките в сигналния път EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK, който регулира клетъчната пролиферация, ангиогенезата, апоптозата и др. В случай на CRC най-често се проявяват мутации на гена KRAS в кодони 12 и 13, но мутациите в кодони 61, 117 и 146 (по-малко от 1%) също имат постоянен акт стимулиращ ефект върху активността на RAS протеина. Резултатът от постоянното активиране на сигналния път EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK, което се случва независимо от състоянието на EGFR, е неутрализиране на ефекта на таргетните лекарства, блокиращи EGFR [2, 4, 10].
Многобройни изследвания са посветени на изучаването на честотата на мутациите в гена KRAS и тяхната връзка с клиничните и патологични характеристики при пациенти с колоректален рак [1]. В Южна България подобни изследвания не са провеждани досега. В същото време населението на тази територия има свои собствени характеристики на населението, което изисква подробно проучване.
Целта на изследването е да се проучи популационният полиморфизъм на 7 SNP мутации от соматичен произход в KRAS гена от туморни биопсии на пациенти с диагноза CRC в Южна България за адекватно предписване на таргетни лекарства (cetuximab, panitumumab). Установена е връзката на откритите мутации с клиничните и патологични характеристики на пациенти, които са били на стационарно лечение във Федералната държавна бюджетна институция "Ростовски научноизследователски онкологичен институт" на Министерството на здравеопазването на България.
Пациенти и методи
Настоящото проучване включва 168 пациенти (73 мъже, 95 жени) на възраст от 28 до 89 години с морфологично потвърдена диагноза аденокарцином на дебелото черво или ректума. От фиксирани в 10% буфериран формалин и вградени в парафин тъканни проби от тумори се нарязват на секции с дебелина 8-10 μm. За молекулярно-генетични изследвания са използвани срезове, съдържащи поне 20% туморни клетки. Процедурата за екстракция на ДНК включва стандартна депарафинизация на срезове с орто-ксилен, промиване с 96% етанол, инкубиране при стайна температура в протеиназа К лизисен буфер за 12 часа и последващо инкубиране при 900°С за 1 час. След това пробите бяха третирани с QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGENE, Германия) съгласно протокола на производителя. Концентрацията на ДНК, изолирана от пробите, се измерва на Qubit 2.0® флуорометър, като се използваКомплект за анализ Quant-iT™ dsDNA с висока чувствителност (HS) (Invitrogen, САЩ). Концентрацията на ДНК се нормализира до стойност от 1 ng/µl. С помощта на комплекта реактиви Real-Time-PCR-KRAS-7M (Biolink, България) бяха определени 7 SNP мутации (Single Nucleotide Polymorphism) в кодони 12 и 13 на KRAS гена: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с термоциклер Bio-Rad CFX96 (Bio-Ra d , САЩ).
Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуерни пакети Microsoft Excel 2010 и STATISTICA 8.0. Разликите в групите се определят според определени характеристики (пол, възраст, локализация на първичния тумор, степен на диференциация на туморни клетки, наличие на метастази в черния дроб, регионални и отдалечени лимфни възли, стадий на заболяването) при пациенти с мутант и див тип на KRAS гена. Разликите бяха оценени с помощта на теста χ2 за нивото на статистическа значимост p 55 години