Биологична химия (биохимия) (стр
| Поради големия обем този материал е разположен на няколко страници: 1 2 3 4 5 6 7 8 |
ЛАБОРАТОРИЯ #5
МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА НУКЛЕИНОВИ КИСЕЛИНИ
Целта на работата: практическо запознаване с методите за изследване на нуклеинови киселини.
Терминът нуклеинови киселини е предложен от немския химик R. Altmann през 1889 г., след като тези съединения са открити през 1868 г. от швейцарския лекар F. Miescher. Той екстрахира клетки от гноен пневмокок с разредена солна киселина в продължение на няколко седмици и получава почти чист ядрен материал в остатъка, наричайки го нуклеин (от латински nukleus - ядро). По свойствата си нуклеинът се различаваше рязко от протеините: беше кисел, не съдържаше сяра и имаше много фосфор. Нуклеинът е силно разтворим в основи, но неразтворим в разредени киселини.
Впоследствие различни нуклеинови киселини са изолирани от животни, растителни обекти и микроорганизми. Най-добрият им източник се оказват клетките с големи ядра.
Хидролизата на нуклеиновите киселини, изолирани от клетъчните ядра, показа, че те се състоят отпурин (аденин, гуанин)ипиримидин (цитозин, тимин) основи, 2-дезоксирибозаифосфонова киселина. От дрожди е получена нуклеинова киселина с различен химичен състав, съдържащаурацилвместо тимин ирибозавместо дезоксирибоза. Тя се наричарибонуклеинова киселина(РНК).
Експериментална лаборатория
Реактиви и оборудване:NaOH (1M); NaCl (1M in20% CH3COOH), етилов алкохол (96%); трихлороцетна киселина (5%), дифениламинов реактив, сярна киселина (5%), разтвор на амоняк (конц.); сребърен нитрат (разтвор на амоняк); центрофуга, водна баня, мерителни колби 100 ml - 4 бр., епруветки 5 ml - 3 бр., пипети 1 ml - 2 бр., колба 25 ml, цилиндър 25 ml, епруветки.
Методът за екстракция на ДНК се основава на факта, че когато наситен разтвор на NaCl в оцетна киселина се добави към тъкан, третирана с основа, протеините се утаяват, докато ДНК и други съединения остават в разтвор. ДНК се отделя от други съединения чрез утаяване с алкохол, последвано от промиване на утайката с трихлороцетна киселина.
Проба от 500 mg чернодробна тъкан предварително се натрошава с ножица и след това се стрива в хаванче с добавяне на 2 ml 1 М NaOH. След това разтворът се излива в епруветка, която се поставя във вряща водна баня за 15 минути, като периодично се разбърква съдържанието. След като пробата се охлади, се добавя 1 ml 1 М NaCl в 20% CH3COOH за утаяване на протеините и след 5–10 минути се центрофугира за 5 минути при 5000 g. След отделяне на супернатанта към него се добавят 10 ml етилов алкохол и се оставят за 1 час в хладилник при температура -20 ° C. В този случай ДНК трябва да се утаи, а РНК е в разтвор. Епруветката се центрофугира отново за 5 min при 5000 g. ДНК пелетата се промива с 5% трихлороцетна киселина.
Експеримент 2.Определяне на съдържанието на ДНК с помощта на дифениламин
ДНК съдържа монозахарида дезоксирибоза, който при взаимодействие с дифениламин (C6H5-NH-C6H5) оцветява ДНК в синьо, докато при взаимодействие с РНК рибоза разтворът става зелен.
Преди да започнете изследването, малко количество ДНК, получено в предишния експеримент, се разтваря в 1ml 1 М NaOH и след това добавете равен обем дифениламинов реагент. Епруветката се поставя във вряща водна баня за 15-20 минути. Наличието на ДНК се оценява по появата на синьо оцветяване.
Под действието на сярна киселина при висока температура протеинът и дезоксирибонуклеиновата киселина се разлагат хидролитично до първични съставки. ДНК се разцепва на азотни основи, дезоксирибоза и фосфорна киселина, а протеинът се разцепва на пептиди и аминокиселини.
Утайката, съдържаща ДНК, се прехвърля в колба за хидролиза и се добавят 15 ml 5% сярна киселина. След затваряне на колбата със запушалка, тя се поставя във вряща водна баня за 1 ч. След охлаждане полученият хидролизат може да се използва за изследване на качествения и количествения състав на основните компоненти.
Опит 4.Определяне на съдържанието на пуринови основи
Среброто образува комплекси с пуриновите бази на ДНК в хидролизата, които се утаяват на дъното на епруветката.
Изсипете 2 ml ДНК хидролизат в епруветка, добавете 5-6 капки концентриран амоняк до алкална реакция на лакмус. След това се налива 0,5 ml амонячен разтвор на сребро. След разбъркване се образува люспеста утайка от пуринови бази със сребърни соли, която се утаява на дъното на епруветката.
1.Какво е нуклеозид, нуклеотид? Защо разтворимостта във вода нараства от база към нуклеотид?
2.Какво е ДНК комплементарност? Каква форма на връзки го определя? Обяснете причината за образуването на двойки аденин-тимин, гуанин-цитозин.
3.Чрез какви връзки нуклеотидните остатъци са свързани в полинуклеотидни вериги?
ЛАБОРАТОРИЯ #6
РЕАКЦИИ НАЕНЗИМИ
Целта на работата: да се запознаят със свойствата на ензимите
Преглед на лабораторията
Ензимитеса специфични протеинови катализатори, синтезирани от живи клетки и имат висока активност.
Ензимите регулират скоростта и специфичността на почти всички химични реакции, протичащи в живите организми, и обикновено работят съвместно: продуктът на една ензимна реакция служи като субстрат за следващата.
Познати са повече от хиляда различни ензими, всеки от които катализира определен вид химична реакция. Хомоложните ензими от различни видове организми са химически различни, дори ако катализират една и съща реакция и на пръв поглед изглеждат идентични. Така например свинският трипсин и кравешкият трипсин са различни съединения.
Ензимните молекули обикновено имат конформация, характерна за глобуларните протеини. Някои от тях се състоят от една полипептидна верига, други от няколко или дори много.